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1、浙江大学硕士学位论文樟科植物提取物对保育期仔猪粪尿氮排放的影响及其机理探讨姓名：石军申请学位级别：硕士专业：动物营养与饲料科学指导教师：陈安国200305012 0 0 3 浙江大学硕士学位论文樟科植物提取物对保育期仔猪粪尿氮排放的影响及其机理探讨摘要本课题研究了樟科植物提取物( C F P E ) 的提取工艺、体外对猪粪中微生物脲酶活性的抑制效果，并以杜太长断奶仔猪为试验对象，研究了在饲粮中添加不同浓度的C F P E 对断奶仔猪生产性能、养分消化率、粪中微生物脲酶活性、粪尿混合液中尿素浓度、粪尿混合物中总氮含量、血清总蛋白和尿素氮水平等的影响，得出C F P E 适宜的提取工艺与断奶仔猪饲
2、粮中适宜的添加量；并探讨了C F P E 的作用机理。本试验分为体外抑制试验与饲养试验两个部分。在体外抑制试验中，选用我国资源丰富的樟科植物的叶片以9 5 乙醇作溶剂，通过不同提取温度( 9 0 、8 0 与5 0 ) 、时间( 1 h 、3 h 、5 h 、8 h 、1 0 h 和2 4 h ) 和提取方法( 蒸馏法和浸提法) 的筛选，对猪粪中微生物脲酶活性体外抑制试验，得出了适宜的提取工艺与适宜的使用剂量，并初步探明了影响提取的一些因素。体外抑制试验结果表明：C F P E 最佳提取工艺为8 0 。C 2 4 h 蒸馏法，提取液适宜使用剂量为4 m l 5 9 粪样，尿酶活性抑制率为3 0
3、 1 4 。在饲养试验中，选取杜大长三元杂交3 0 1 日龄断奶仔猪5 7 6 头，按胎次、体重相近和公母基本一致分成6 组：I 空白；I I 添加2 C F P E7 5 预混剂( 饲料中含1 5 0 m gC F P E k g ) ；I I I 添加2 C F P E1 5 0 预混剂( 饲料中含3 0 0 m gC F P E k g ) ；添加2 C F P E2 2 5 预混剂( 饲料中含4 5 0 m gC F P E k g ) ；V 添加2 C F P E3 0 0 预混剂( 饲料中含6 0 0 r a gC F P E k g ) ；V I 添加l C F P E 4 5
4、0 预混剂( 饲料中含4 5 0 m gC F P E k g ) ，每组三个重复，每个重复3 2 头，各处理组仔猪均采用干湿饲喂器饲喂，相邻两栏合用一个干湿饲喂器一个饲喂器为一个重复，断奶仔猪均饲养于保育舍猪舍，至6 8 日龄结束，为期3 8 天。试猪分两期饲喂两种日粮，一期日粮自3 0 日龄饲喂至5 4 日龄，然后换喂二期日粮。在两期日粮饲喂结束前，分别按内源指示剂酸不溶灰分( A I A ) 法收集粪便、制样，测定干物质和粗蛋白的表观消化率。在整个试验期中分为前期、中期、后期三次采集粪样，采样日期分别设定在试验开始后第1 4 、2 1 、2 8 天的上午7 ：3 0 8 ：0 0 ，随机
5、采集仔猪粪，装于密闭塑料袋中带回实验室，测定脲酶活性、尿素浓度、总氮含量等指标。试验结束后禁食1 2 小时进行前腔静2 0 0 3 浙江大学硕士学位论文脉采血、空腹称重、统计饲料消耗。现将上述试验结果分为生产性能、消化试验、脲酶活性测定、尿素浓度测定、总氮含量测定、血清生化指标测定等逐一阐述如下：饲养试验结果表明，在饲粮中添加2 C F P E l5 0 预混剂( 含3 0 0 r a gC F P E k g 饲料) 的第和2 C F P E 2 2 5 预混剂( 含4 5 0 m gC F P E k g 饲料) 的组试验猪的末重分别比第1 组( 对照组) 提高4 9 0 ( P 除臭时间
6、 臭气浓度 除臭温度，茶叶提取物添加量、除臭时间、臭气浓度对除臭率有显著影响。对硫化氢、甲醛、乙醛、吲哚类臭气来讲，除臭时间长短对除臭作用贡献较大，对甲胺、三甲胺类臭气而言，在茶叶提取物添加量为O 0 5 9 时除臭率就已达9 5 左右。对各种臭气物质的除臭率随茶叶提取物添加量的增加或除臭时间的延长而增加。在前2 0 m i n ，除臭率迅速提高，4 0 m i n 过后，除臭率变化趋势较平缓，4 0 m i n 后，除臭率上升很小。从试验中得到茶叶提取物对氨气、硫化氢、吡啶、甲醛、乙醛、甲胺、三甲胺、吲哚的最大除臭率分别为( 9 0 2 8 1 1 1 ) 、( 8 9 0 5 1 1 6
7、) 、( 8 8 9 8 1 4 1 ) 、( 5 5 2 5 1 2 5 ) 、( 4 0 9 7 - t - 0 9 1 ) 、( 9 9 3 5O 0 0 ) 、( 9 9 6 3 O 0 0 ) 、( 4 3 5 6 - t - 0 8 7 ) ，其中，对甲胺、三甲胺的除臭能力最强，而对92 0 0 3 浙江大学硕士学位论文甲醛、乙醛和吲哚的除臭能力要弱一些。唐裕芳等( 2 0 0 0 ) 通过聚乙烯吡咯烷酮( P V P ) 对茶叶提取物中多酚类含量及除臭效果影响的研究认为茶叶提取物除臭可能主要为茶多酚的作用，并且可能是儿茶素B 环上的O H 提供H + 同N H 3 反应生成铵盐而
8、使臭味减弱或消失。史清河等( 2 0 0 1 ) 在综述中报道猪饲料中添加茶多酚可以明显减少氨浓度。而V e u m 等( 1 9 9 7 ) 却未发现茶多酚对猪排泄物中的氨气、苯酚、p 一甲苯酚、吲哚和3 甲基吲哚有影响。1 1 4 通过消化道微生态调节剂的使用进行控制通过在猪日粮中添加微生物或其可利用的底物可以调控猪胃肠后段中存在的微生物区系，进而影响氮和硫的消化与利用( Y u nSe ta l ，1 9 9 7 ；史清河等，2 0 0 1 ) 。日本学者筛选出一种被称为太古菌的细菌，将其添加到饲料中饲喂生猪，发现其排泄物中的氨气几乎全部消除，硫化氢降低9 8 ，甲烷降低5 0 左右(
9、邓红喜，1 9 9 9 ) 。朱万宝等( 2 0 0 0 ) 用主要由蜡状杆菌、酵母菌等4 种微生物菌种组成的益生菌剂( 每克含有效活菌数 5 1 0 8个) 饲喂断奶仔猪，结果发现可以仔猪的平均日增重提高，料肉比降低，腹泻发生率减少，并且粪便中硫化物及N H 4 + _ N 的含量分别降低了2 8 5 和1 9 4 ，从而减轻了粪便的臭味。M a t h e w 等( 1 9 9 3 ) 发现，日粮中添加木糖( 1 ) 可以使仔猪断奶后回肠内容物有更低的p H 值，更少的大肠杆菌数( P 0 0 5 ) ，更少的K 8 8 + 大肠杆菌，使盲肠中的乙酸和异丁酸降低( P 0 0 1 ) ，但
10、总的V F A 保持不变。1 2 粪中微生物脲酶对氨气挥发的影响已研究证实，猪排泄物所散发的氨主要来自于尿中的尿素，而极少数来自于粪( H a r t u n gJe ta l ，1 9 9 4 ) 。而尿素是在粪中微生物脲酶活性的作用下，在粪尿混合后被快速分解为N H 3 而释放到周围空气中的( B r a a mCRe ta l ，1 9 9 9 ；史清河，2 0 0 0 ) 。腮酶又名尿素酰胺水解酶，广泛存在于各种细菌、真菌和植物中，在自然界的氮循环中发挥了重要的作用。它能利用自身的2 个金属镍离子活性中心，催化尿素生成氨气，这是有机氮矿物化的最后一步( B a r b a r aKe
11、ta l ，2 0 0 l ；B e n i n iSe ta l ，1 9 9 9 ) 。自然隋况下，粪氮降解成N H 3 的过程比尿氮降解成N H 3 的过程要慢得多( C a n hTTe ta l ，1 9 9 7 ) 。有脲酶存在的情况下，可使尿素的分解在半微秒内发生且速度比一般情况下快1 0 “倍( S t e f a n oCe ta l ，1 9 9 9 ) ，在分解过程中产生的氨基甲酸盐在机体生理p H 马上分解生成第二个氨气分子和重碳酸盐( A n d r e w s R Ke t a l ，1 9 9 8 ) ，见图1 1 。氨气的挥发还受到温度、湿度、p H 值的影响(
12、 V a n2 0 0 3 浙扛大学硕士学位论文HH ，1 9 9 6 ) 。水解产物直接导致的口H 值上升会加快氨气的逸散，这是脲酶对机体和环境的最重要的副作用( S t e f a n oCe ta l ，1 9 9 9 ) 。另外，脲酶产生的氨气可导致消化道p H 的上升使有害微生物的生长加快，还会引起动物尿道和胃肠道的感染，并与肾结石的形成、导尿管表皮硬化、肾盂肾炎和肝昏迷有关( S t e f a n oCe ta l ，1 9 9 9 ) 。总而言之脲酶活性对家畜和环境的有害影响是巨大的多样的。州八oN 吃”p t 堕堕L J 獭+ N 吡1l 峪 H f + t , 4 1 ,
13、1 a图1 1 脲酶催化尿素水解示意图1 3 国内外对脲酶结构与作用机制的研究尽管从不同的细菌和植物中获缛的脲酶的亚基的的结构，数目，类型都不相同，但B e n i n ie ta l ( 1 9 9 6 ) 研究发现，目前已知的许多脲酶都具有高度保守的氨基酸序列。5 0 以上是相同的。在众多的脲酶中，最有代表性的脲酶是从刀豆中获得的脲酶( K o tM ，2 0 0 0 ) 。它是1 9 2 6 年眭t S u m n e r 结晶成功，这是世界上第一个被结晶成功的酶。刀豆脲酶是一种由不同亚基组成的六聚体酶，带有两个镍离子( S t e f a n oCe ta l ，1 9 9 9 ；K
14、o tM ，2 0 0 0 ) 。到目前为止，还没有关于脲酶结构的定论，但各种报道都有关于脲酶的活性是和镍离子有关的这说法。K o tM ( 2 0 0 0 ) 报道，Z e m e r 在1 9 8 4 年就提出了脲酶的括性中心，脲酶在中性p H 条件下时有一个水分子和两个镍离子中的一个结合在一起，而另一个镍离子则和氢氧根离子结合在一起，三个氨基酸的残留物：巯基、羧基和另外一个未知的基团也在脲酶的活性作用中扮演了重要的角色，在催化的过程中，脲素在两个镍离子之闯起架桥作用形成一个过渡性四面体，两个镍离子之间距离为3 ，5 A ，每一个镍离子都以N 和O 原子为连接物和两个吲哚结合在一起( 见图
15、1 2 ) 。S t e f a n oCe ta l ( 1 9 9 9 ) 报道的脲酶模型贝| J 为：在一个扭屈的八面体中，镍离子以2 0 6A 为距离和5 或6 个N ，O 原子结合在一起。目前对于脲酶的作用机制还不太清楚。S t e f a n oCe ta l ( 1 9 9 9 ) 报道，脲酶在催化过程中。首先是尿素进入到腮酶中的活性通道，并取代其中的一定结构，然后由尿素的羧基结合到脲酶中亲电子能力更强的连接五配位体的镍原子上，而尿素的氨基结合到连接六配位体的另一个镍原子上。2 0 0 3 浙江大学硕士学位论文F i g , L “ l l l l l I C l i - cs
16、批时删I 嫡件叶1 w o m i c h l I 砷出眦i , r i d i 筘a “ t h a l b 【I 哗e dL 椎2 l ，西d u c I 沁f i i n l l e r 伽l d l l i i l l l 竹 H 珲i ! i i l , sj 辩 s P 毒砷i n l l 坤d ”洲o h , l l _ h i kN i - I 缸l u m l l l e r 。舶 凼B 一竹l l l l3 “i l n i ll i l ! im 拍e 时d i o l l e n 山眦孤t o o lH 1 日哺图1 2 刀豆脲酶活性中心的立体结构示意图1 4 脲酶抑制剂的研究及其在动物营养中的应用利用脲酶抑制剂去控制脲酶对尿素的分解极有可能会提高的植物对氮肥的利用效率，减少养殖业过程中产生的氨气对环境的危害，已渐渐
