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1、摘 要 I摘 要 本研究采用微卫星分子标记技术对石岐肉鸽进行了亲子关系的鉴定，选用 7 对原鸽微卫星引物，通过其在石岐肉鸽基因组上进行多态扩增，计算出了各位点的杂合度、多态信息含量、有效等位基因数、非父排除率等，结果如下： 在 187 只石岐肉鸽 DNA 基因组中， 7 个微卫星位点共得到 36 个等位基因， 其中 ClimD16 和 ClimD01 的位点最多为 6 个。根据位点的等位基因频率，得到这 7 个位点的基因杂合度介于 0.650-0.812 之间，平均为 0.758；多态信息含量值介于 0.583 -0.782 之间，平均值为 0.715；有效等位基因数在 2.8521-5.25
2、26 之间，平均为 4.2903。结果表明该石岐肉鸽种群有较为丰富的遗传多样性，为后续研究提供了依据。 利用选取的 7 个多态微卫星位点，成功的对该石岐肉鸽种群进行了亲子鉴定 ，修正了试验鸽厂中谱系记录的错误，为该厂肉鸽的繁育提供便利。同时计算了各个位点的非父排除率处于 0.374-0.620 之间，7 个微卫星位点的累计非父排除率为 0.9956。 本研究采用 PCR 技术和琼脂糖凝胶技术， 利用 CHD 基因和 EE0.6 序列的相关引物， 对已知性别的 48 只野鸽和未知性别的 216 只石岐肉鸽的性别进行了准确的鉴定。结果表明： 1 利用 CHD 基因引物 2550F/2718R 对已
3、知性别野鸽的基因组 DNA 进行 PCR 扩增，扩增结果为雌性两条带，雄性为一条带，依据该结果对 216 只未知性别的石岐肉鸽进行性别鉴定，并成功克隆石岐肉鸽的 CHD-Z 和 CHD-W 基因片段。 2 利用 EE0.6 序列引物对已知性别野鸽的基因组 DNA 进行 PCR 扩增，扩增结果为雌性为一条带，雄性无扩增产物，依据该结果对 216 只未知性别的石岐肉鸽进行性别鉴定，并成功克隆石岐肉鸽的 EE0.6 序列片段，已发布到 GenBank（Accession No:FJ598049.1） 。 3 依据上述对 216 只同日龄石岐肉鸽的性别鉴定结果，将性别与这些肉鸽的活重、屠体重和全净膛重
4、进行统计分析，结果表明，性别对于肉鸽的活重、屠体重和全净膛重都有极显著的影响（P0.5） ，可以提供较多的多态信息含量。 3.2.8 有效等位基因数 本试验计算出 7 个微卫星位点在肉鸽 DNA 基因组中的有效等位基因数在 2.8521-5.2526之间，平均为 4.2903，其中 ClimD17 是 2.8521 为最小，ClimD32 是 5.2526 是最大的。通过对有效等位基因数的计算，从表 3-2 和表 3-3 对比发现：有效等位基因数要小于等位基因数，这是因为有些等位基因在种群中分布不均匀导致的。 3.2.9 非父排除概率 由 7 个微卫星位点的等位基因频率，利用 Cervus 程
5、序计算出 7 个位点的非父排除概率，结果见表 3-3，从表中可以看出，7 个位点的非父排除概率在 0.374-0.620 之间，分布较为均匀，进而计算了 7 个位点的累积非父排除概率，7 个位点的累积非父排除概率达到 99.56%。 表 3-3 7 个微卫星位点的基因杂合度、多态信息含量、非父排除概率和有效等位基因数 Table 3-3 Genetic heterozygosity、polymorphism information content、excluding probability of paternity、and effective number of alleles at 7 mi
6、crosatellite loci 位点 基因杂合度 多态信息含量非父排除率 有效等位基因数Locus Genetic heterozygosity Polymorphism information content Excluding provbability of paternity Effective number of alleles ClimT17 0.784 0.748 0.570 4.6366 ClimT13 0.743 0.697 0.505 3.8822 ClimD19 0.721 0.668 0.466 3.5623 ClimD01 0.804 0.773 0.606 5.0
7、942 ClimD16 0.793 0.758 0.585 4.7528 ClimD17 0.650 0.583 0.374 2.8521 ClimD32 0.812 0.782 0.620 5.2526 平均 0.758 0.715 0.9956 4.2903 东北农业大学理学硕士学位论文 363.3 性别和主要生产性状关系 3.3.1 CHD 基因 3.3.1.1 PCR 扩增结果 利用CHD基因引物2550F/2718R对48只已知性别的野生灰鸽的基因组DNA进行了PCR， 引物扩增结果同记录相同。 部分个体扩增结果如图， 清晰显示： 1-8号的雌性个体均扩增出2条带，片段大小分别是50
8、0bp和750bp左右， 9-16号的雄性个体均扩增出1条带， 片段大小是750bp左右，同雌性长片段相同（如图3-10），证明该引物能有效鉴定鸽的性别，可应用于石岐肉鸽的性别鉴定。 图3-10 已知性别野生灰鸽CHD基因扩增片段 M：DL 2000 分子量标准；泳道 1-16：PCR 产物；泳道 17：对照 Fig. 3-10 Sequences amplified from CHD gene of sex-known wild grey pigeon M：DL 2000 Marke；Lane1-16：PCR product；Lane17：Control 利用引物2550F/2718R对21
9、6只未知性别的石岐肉鸽基因组DNA进行PCR扩增，部分结果见图（3-11），个体2、3、4、6、7、8、11、12、16的扩增产物为2条带，片段大小分别是500bp和750bp左右，可以将其判定为雌性，而个体5、9、10、13、14、15、17的扩增产物为1条带，片段大小是750bp左右同雌性长片段相同，可以将其判定为雄性。 结果与分析 37图3-11 未知性别石岐肉鸽CHD基因扩增片段 M：DL 2000 分子量标准；泳道 2-17：PCR 产物；泳道 1：对照 Fig. 3-11 Sequences amplified from CHD gene of sex-unknown shack-
10、Kee M：DL 2000 Marker；Lane2-17：PCR product；Lane1：Control 3.3.1.2 PCR 产物的克隆测序 选取雌雄肉鸽各 1 个个体的基因组进行 PCR 扩增，对相应的 PCR 产物进行琼脂糖凝胶回收，将回收产物连接到载体进行克隆、测序，酶切鉴定，经酶切鉴定得到两条条带，一条与 pMD18-T 大小一致，另一条与预期的 CHD-Z，CHD-W 基因片段大小相符，证实得到插入有目的片段的 pMD18-T 阳性克隆，结果见图 3-12。 图 3-12 酶切鉴定结果 M：DL 2000 分子量标准；14：酶切产物 Fig. 3-12 Identifyin
11、g results of PCR products cut with restriction enzyme M：DL 2000 Marker；14：PCR Product cut with restriction enzyme 经华大公司测序得到片段大小为 635bp 的 CHD-Z 基因序列， 将所测序列通过 NCBI 数据库的 Blast 比对分析， 结果表明石岐肉鸽 CHD-Z 基因序列同原鸽 （Accession No:AY517719.1）的同源性为 99%（见图 3-13），与东方白鹳（Accession No:EU814908.1）的同源性为 80%、琵鹭（Accession N
12、o:AY464013.1）的同源性为 80%、鸬鹚（Accession No:AB112958.1）的同源性为 80%、鹰（Accession No:AY112953.1）的同源性为 79%。该结果充分证明了测序结果的可靠性。 东北农业大学理学硕士学位论文 38Query 为石岐肉鸽测序序列，Sbjct 为原鸽序列 图 3-13 石岐肉鸽与原鸽的 CHD-Z 基因序列同源比较结果 Fig 3-13 The compared result between the CHD-Z sequence of shack-Kee and Columba livia 经华大公司测序得到片段大小为 446bp
13、的 CHD-W 基因序列，将所测序列通过 NCBI 数据库的 Blast 比对分析，结果表明，石岐肉鸽 CHD-W 基因序列同原鸽（Accession No:AY517718.1）的同源性最高为 99%（如图 3-14），与鸬鹚（Accession No:AB080661.1）的同源性为 89%、琵鹭（Accession No:AY464014.1）的同源性为 89%、东方白鹳（Accession No:EU814915.1）的同源性为 89%、冠鹤（Accession No:EF078973.1）的同源性为 88%。该结果证明了测序结果的可靠性。结果与分析 39Query 为石岐肉鸽测序序列
14、，Sbjct 为原鸽序列 图 3-14 石岐肉鸽与原鸽的 CHD-W 基因序列同源比较结果 Fig 3-14 The compared result between the CHD-W sequence of shack-Kee and Columba livia 3.3.2 EE0. 6 序列 3.3.2.1 PCR 扩增结果 利用EE0.6序列EE0.6F/EE0.6R这对引物组合对48只已知性别的野生灰鸽的基因组DINA进行了PCR，引物扩增结果同记录相同。部分个体扩增结果如图，1-8号的雌性个体均扩增出1条带，片段大小是250bp左右，9-16号的雄性个体无扩增条带（图3-15），证明
15、该引物能有效鉴定鸽的性别，可应用于石岐肉鸽的性别鉴定。 东北农业大学理学硕士学位论文 40图3-15 已知性别野生灰鸽EE0.6序列扩增片段 M：DL 2000 分子量标准；泳道 1-16：PCR 产物；泳道 17：对照 Fig.3-15 Sequences amplified from EE0.6 sequence of sex-known wild grey pigeon M：DL 2000 Marker；Lane1-16：PCR product；Lane17：Control 利用引物EE0.6F/EE0.6R对216只未知性别的石岐肉鸽基因组DINA进行PCR扩增，部分结果见图（3-16
16、），个体2、3、4、6、7、8、11、12、16的扩增产物为1条带，大小为250bp左右，可以将其判定为雌性，而个体5、9、10、13、14、15、17没有扩增条带，可以将其判定为雄性。 图3-16 未知性别石岐肉鸽EE0.6序列扩增片段 M：DL 2000 分子量标准；泳道 2-17：PCR 产物；泳道 1：对照 Fig. 3-16 Sequences amplified from EE0.6 sequence of sex-unknown shack-Kee M：DL 2000 Marker； Lane2-17:：PCR product； Lane1：Control 3.3.2.2 PCR 产物的克隆测序 选取雌性肉鸽 1 个体的基因组进行 PCR 扩增， 对相应的 PCR 产物进行琼脂糖凝胶回收，并将回收产物连接到载体进行克隆、测序，酶切鉴定，经酶切鉴定得到两条条带，一条与pMD18-T 大小一致，另一条与预期的 EE0.6 序列片段大小相符，证实得到插入有目的片段的pMD18-T 阳性克隆，结果见图 3-15。 结果与分析 41经华大公司测序得到片段大小为
