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1、 分类号：R764.43 密级：公开高迁移率族蛋白 1在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达及作用机制High Mobility Group Box ChromosomalProtein 1 in the Pathogenesis of ChronicRhinosinusitis with Nasal Polyps作者姓名：陈黛诗学科专业：耳鼻咽喉科学导 师：陈雷教授答辩委员会主席：论文答辩日期：二一三年五月十七日院校地址：北京市复兴路 28号邮政编码：100853 解放军医学院研究生学位论文原创性声明秉承我院“敬业、勤奋、求实、创新” 的学风，本人声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及
2、取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书而使用过的材料，对本文的研究作出贡献的个人或集体，均已在文中做了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：指导教师签名：日期：日期：解放军医学院研究生学位论文版权使用授权书本人保证毕业离院后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为解放军医学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文原件、复印件和电子版本，可以采用影印、缩印、扫描或其它手段保存论文以供被查阅和借阅。学院可
3、以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外）。论文作者签名：指导教师签名：日期：日期： 目 录 英文缩略词表1中文摘要3英文摘要5前言8第一部分 HMGB1 在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达及意义12材料与方法12结果21讨论29参考文献33第二部分 脂多糖对人鼻黏膜上皮细胞 HMGB1 表达的影响及意义36材料与方法36结果39讨论43参考文献47文献综述50攻读学位期间发表论文60致谢61 解放军医学院硕士学位论文 英文缩略词表缩 写AESAMPKAPSBEGMCKCRSwNPDMEMDAMPsEDTAEOSEPOESFBSFSH.EHMGB1HNECHRPIHCIL-5IL-8LPSMBP
4、mRNAMSNF-BOCTODOMCSPCD英文全称Anterior ethmoid sinusadenosine 5-monophosphate kinaseAmmonium persulfate Bronchial epithelial growth mediumCytokineChronic rhinosinusitis with nasal polypsDuleccos modified eagles mediaDamage associated molecular pattern moleculesEthylene diamine tetracetic acidEosinophilE
5、osinophil peroxidaseethmoid sinusFetal bovine serumFrontal sinusHematoxin eosinHigh mobility group box chromosomal protein 1Human nasal epithelial cellsHorseradish peroxidaseImmunohistochemistryInterleukin-5Interleukin-8LipopolysaccharidesMajor basic proteinMessenger ribonucleic acidMaxillary sinusN
6、ucelar factor-kappa BOptimal cutting temperature compoundOptical densityostiomeatal complexPrimary ciliary-dyskinesia中 文前筛窦腺苷酸活化蛋白激酶过硫酸铵支气管上皮培养基细胞因子慢性鼻窦炎伴鼻息肉Dulecco 改良细胞培养基损伤相关分子模式乙二胺四乙酸二钠嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞过氧化物酶筛窦胎牛血清额窦苏木素-伊红高迁移率族蛋白 B1人鼻黏膜上皮细胞辣根过氧化物酶免疫组织化学白细胞介素 5白细胞介素 8脂多糖主要碱性蛋白信使核糖核酸上颌窦核因子-B冰冻切片包埋剂光密度值窦口
7、鼻道复合体原发性纤毛不动症1 解放军医学院硕士学位论文 缩 写TEMEDTNF-TLRsPBSPMSFPESPVDFRT-PCRSDS-PAGESS英文全称N,N,N,N-Tetramethylethylene-diamineTumor necrosis factor-Toll like receptorsPhosphate buffer salinePhenylmethylsulfonyl fluorideposterior ethmoid sinusPolyvinylidene fluorideReverse Transcription-Polymerase Chain ReactionS
8、odium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electropheresissphenoid sinus中文四甲基乙二胺肿瘤坏死因子-Toll 样受体磷酸盐缓冲液苯甲磺酰氟后筛窦聚偏氟乙烯膜逆转录聚合酶链式反应聚丙烯酰胺凝胶电泳蝶窦2 解放军医学院硕士学位论文 高迁移率族蛋白 1 在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达及意义中文摘要慢性鼻窦炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps, CRSwNP）是鼻腔和鼻窦黏膜的慢性炎症性病变，通常与感染（病毒、细菌、真菌等）、 变态反应和粘液纤毛传输功能障碍等多种因素共同作用的结果
9、。组织形态学特点表现为上皮细胞损伤，炎性细胞浸润和上皮下层水肿。广 义而言，炎症是一种机体对感染和损伤的自我保护机制，而炎性细胞的长期浸润，且不断释放的炎性介质和细胞因子（如IL-5、IL-8、TNF-、IFN- 和RANTES等）相互作用，促进鼻黏膜局部炎症反应不断循环扩大。近年来，研究发现新的“晚期炎性因子”高迁移率族蛋白1（High mobility groupbox 1, HMGB1）在炎症网络中的起到关键作用，它可以直接作用于各种炎性 细胞（包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞），诱导其释放多种促炎性或炎性介质，启动机体的天然和获得性免疫过程。已有研究表明，HMGB1在COPD患者的呼吸道上
10、皮细胞中和变应性鼻炎患者的鼻腔分泌物中过表达，但是作用机制尚未被阐述。本研究，我们拟用免疫组化、Western blot、RT-PCR 等 实验方法探讨HMGB1 在CRSwNP中的作用和意义，加深我们对CRSwNP发病机制的 认识，为CRSwNP的治疗提供新的实验和理论依据。第一部分 HMGB1在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达及意 义目的：研究 HMGB1在慢性鼻窦炎伴鼻息肉及正常鼻黏膜中的表达水平，以探 讨其在鼻息肉形成过程中发挥的作用。方法：对 41例鼻息肉组织及 9例正常鼻黏膜组织分别进行免疫组化、Western blot和 RT-PCR法检测 HMGB1、IL-5、IL-8、TNF-及其
11、 mRNA水平。结果：1.免疫组化显示HMGB1蛋白在嗜酸性粒细胞性和非嗜酸性粒 细胞性鼻息肉均较正常对照组高；2. Western blot显示HMGB1蛋白水平在嗜酸性粒细胞性鼻息肉明显高于正常对照组和非嗜酸性粒细胞性鼻息肉(P值分别为 0.044，0.001); 3.HMGB1 mRNA，IL5，IL8和TNF- mRNA在嗜酸性粒细胞性鼻息肉中表达上调，但在非嗜酸性粒细胞性鼻息肉和正常对照组中相似；4. HMGB1 mRNA 与IL5 ，IL8，TNF- mRNA存在正相关性（r s分别为 0.665, 0.771, 0.724; P值均0.05）。表 2 显示， Eos CRSwNP
12、 组鼻窦冠状位 CT评分及临床症状评分高于 non-Eos CRSwNP 组，除上颌窦、额窦评分，余各指标两组比较均有显著性差异（P 值均0.05）。图 2 HMGB1 蛋白在鼻息肉与正常对照组中的表达 阳性细胞主要位于上皮细胞胞核、胞浆和黏膜下浸润的炎性细胞内和组织间隙，阳性呈棕黄色，阴性细胞无着色。免疫组化二步法400 A：对照组鼻黏膜；B：non-Eos CRSwNP 组鼻黏膜；C：Eos CRSwNP 组鼻黏膜；D：non-Eos CRSwNP 组黏膜下炎性细胞；E-F：免疫组化半定量分析24 解放军医学院硕士学位论文 注：结果采用箱图表示，箱图主体的上、中、下三条线分别表示变量值第
13、75、50、25 百分位数，上、下截止横线分别表示最大值、最小值；两两比较采用 Mann-Whitney U 法 *P0.05）。25 0.006 ，0.01b解放军医学院硕士学位论文 图 3 IL-5, IL-8 和 TNF- 在鼻息肉与正常鼻黏膜组织中的表达 阳性细胞主要位于黏膜下炎性细胞内，胞核或胞浆呈棕黄色，阴性细胞无着色。免疫组化二步法400A-C：分别是鼻息肉组 IL-5, IL-8 和 TNF-；D-F：对照组鼻黏膜 IL-5, IL-8 和 TNF-；G-I：Eos CRSwNP 组和 non-Eos CRSwNP 组免疫组化半定量分析注：采用独立样本 t 检验 *P0.05）
14、；Eos CRSwNP 组中各指标的表达均高于正常对照组和 non-Eos CRSwNP 组，差异有统计学意义（P 值均0.05），两者不存在统计学意义。28 解放军医学院硕士学位论文 图 6 鼻息肉与正常对照组鼻黏膜组织中 HMGB1 蛋白相对表达量注：Eos CRSwNP 组，non-Eos CRSwNP 组和正常对照组两两比较 *P0.05）。LPS 刺激前，HMGB1 高丰度表达于上皮细胞的细胞核内，LPS 刺激 24 h 后，可观察到细胞核内的 HMGB1 开始转移到细胞质，分布在细胞质或分泌到细胞外（图 2），随着刺40 解放军医学院硕士学位论文 激时间的延长（48-72 h），胞质中 HMGB1 的表达逐渐增多，部分细胞核无 HMGB1表达。41 注：*：与 0 h组比较；#：与 12 h比较； 24 h比较；*P0.01， #P0.05，#P0.01解放军医学院硕士学位论文 图 2 免疫荧光观察 LPS 刺激鼻黏膜上皮细胞在不同时间点 HMGB1 的表达定位（400 ） A 0 h；B 12 h；C 24 h；D 48 h；E 72 h; F HMGB1 和 -tublin 免疫荧光双标染色；白箭头 HMGB1 在胞浆表达； 黄箭头： H
