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1、茶叶功能成分提取制备专题 (五)茶多糖的提取制备技术崔宏春“江和源”张建勇江 用文(1.农业部茶及饮料植物产品加工与质1控制重点 开放 实验室,中国农业科学院茶叶研究所,3 1( XX )8;2.中国农业科学院研究生院 )茶多糖(T eoP ol ysa cc ha r id e,T巧)是 一种类似灵芝多搪和人参多糖的高分子化合物,其杰出功效是降血糖、降血脂,从而达到防治糖尿病的作用川。同时在抗凝血、防血栓形成,保护血相和增强人体非特异性免疫能力等方面均有明显效果1 2 1,是一种很有开发前景的天然产物。我国和日本民间均有用粗老茶治疗糖尿病的传统洲,;茶叶愈粗老治糖尿病的效果愈好匀,常饮茶的人
2、高血压、冠心病的患病率较低网。近年来有关茶多糖及其药理作用的研究报道逐渐增多,日本学者清水岑夫研究发现,茶叶治疗糖尿病的主要药理 成分是茶多韧阁。在茶叶中,茶叶多糖占1.0 %一3 . 5%,并且随原料的老嫩、茶树品种、采摘季节及加工工艺的不同含量有所差异,一般老叶比嫩叶含量高阴。目前市场上中低档茶严重滞销,在茶叶加工过程中也有大量的枝叶和灰末等副产品未被利用,若从中提取茶多糖作为保健食品的功能成 分,则可为中低档茶的综合利用开辟一条新途径。一、茶多糖的提取工艺现茶多糖的提取方法,主要有酸提法、碱提法、水提法、微波辅助提取法、酶提法和超声波提取法等1 1 0 -1 4 1。酸提法和碱提法对提取
3、条件要求较高,用稀酸提取,时间宜短,温度不宜过高;用稀碱提取,应在氮气中进行,以防止多糖降解。1.映提法和超声波提取法酶工程技术是近年来用于天然植物有效成分提取的一项新型生物工程技术,选用合适的酶,可较温和地将植物组织分解,加速有效成分的释放,从而提高得率。王元凤等l l q将复合酶和果胶酶用于茶多糖的提取,使得茶叶细胞壁破裂,促进多糖的溶出,使茶多糖提取率达到了2 .2 1%。超声波提取主要是利用超声波在液体中的空化作用加速植物有效成分的浸出提取,具有高效、适用性广、条件温和等优点1 1气2.水提法酶提法和超声波提取法的成本较高,因此在实际生产中仍以水提法为主。有关茶多糖水提取工艺的研究,国
4、内有项目资助:国家 9 48项目资助,*通讯作者,jia ng hyl . lr i ca a s.c o m。许多报道问,可分为单独提取法和综合提取法。(l)茶多糖单独提取法。单独提取法又可分为以下3种。a.原料一水浸提(2一3次)叶沉淀过滤叶取滤液 浓缩一乙醉沉淀一过滤、回收乙醉叶粗多糖一精制、干燥神茶多糖。黄杰等研究了浸提温度、浸提时间、料液比对茶多搪得率、含量及蛋白质含量的影响,得出浸提温度宜在 5 5,浸提时间宜为3 h,料液比达到1:2 5即可I l s 。而曹鹏飞用正交实验得出最佳提取条件为:料液比卜1 0,浸提时间为6 0mi n,浸提温度为10 0,沉淀时所用的乙醇浓度为7
5、5%l.飞b.原料斗乙醉浸 泡回流(3次)“取滤渣神水浸提(3次 )神过滤”提取液浓缩、脱脂、脱蛋白、脱色等“乙醉沉淀(2次 )弓取滤渣精制、干燥斗茶多糖。和方法a相比,该方法在原料提取前用乙醇浸泡脱去一些酚类色素和溶于醇的小分子杂质,为纯化精制打下了基础。周小玲用l: 5的酒精于3 0恒温下振摇30 mi n对原料进行处理,泡至上层酒精无色后再进行提取,并采用二次响应面法优化提取工艺,得出最优提取工艺为浸提温度s o,浸提时间l.sh,料水比l:2口浏。c.原料弓预处理 (乙醉浸 泡或者酶水解)水浸提叶超滤一取滤液“乙醉沉淀”干燥斗茶多糖。该方法在前两种方法的基础上将超滤膜引人到茶多糖的提取
6、工艺中,用超滤法对提取液进行粗分离,实现了茶多糖与茶多酚、咖啡碱的分离,提高了多糖的纯度。(2)茶多糖综合提取法。该方法的最后产物不但得到茶多糖,还可得到咖啡碱和茶多酚,具有简化、效益高等优点。大致可分为2种( 图1)。这2种方法的区别在于前者是用水提取,而后者是用醇提取的,并且后者用了丙酮进行粗分离。这2种方法的出现,为粗老茶、陈茶以及茶渣的综合利用开辟了新途径。二、茶多精的分离纯化通过提取得到的只是茶叶粗多糖,可能还含有与其分子a.原料叶沸水漫提(2次)叶离心、除渣升提取液氛仿革取升有机层回收、精制、干燥叶咖啡碱有机层回收、精制、干燥“茶多酚水层乙酸乙醋革取弓、水层乙醉醉析*离心、取滤渣、
7、精制、干燥叶茶多糖b.原料神乙醉浸提弓滤渣酸性乙醉提取衬滤液丙酮分离*回收、精制、干燥茶多糖滤液浓缩氛仿萃取一有机层回收、精制、干燥叶咖啡碱(有机层回收、精制、干卜茶多酚水层乙酸乙醋不取神亏水层浓缩、干澡升水溶性复合物图1茶多精综合提取法因多次除蛋白而损失。三氟三抓乙烷法效率较高,但因其易挥发,不宜大量应用。三抓乙酸法脱蛋白效果较好,但此法较为剧烈,会引起某些多糖的降解,使得率降低。3.沉淀法分离 多糖不溶于高浓度的乙醇、丙酮从而沉淀析出。常用的多糖沉淀法有分部沉淀法和季胺盐沉淀法。分部沉淀法是利用不同多糖在不同体积分数的乙醇或丙酮中具有不同溶解度的性质,通过改变有机 提取溶剂的比例来沉淀分离
8、各种质量相差不大的水溶性物质、色素、脂类、低聚糖等杂质,为 得到茶叶多糖的均一性组分,必须对其进行分离纯化。方法主要有脱色法、脱蛋白法、沉淀法、超滤法、柱层析法等。1.脱色法茶叶中含有的色素主要是多酚类物质,多酚类物质极易氧化,并且氧化后颜色更深。这些色素物质加重了茶多糖 的色泽,给茶多糖的结构分析、作用机理及构效关系的研究 带来了困难,因此对提取的粗多糖必须进行脱色处理。目前,较为成熟的脱色方法主要有:活性炭脱色法、树脂脱色和双氧水脱色。活性炭脱色是依靠范德华力将色素吸附到活性炭表面,活性炭的颗粒愈小,其表面积愈大,吸附能力愈强。但活性炭脱色样品损失较大,对于从动植物中提取的天然多糖,由于量
9、都很少,所以一般不用活性炭脱色口,。树脂脱色是近年新发展起来的一种脱色方法,其脱色 效果好,适合于处理量小、猫性小、色素含量较少的体系,否则易造成树脂污染,再生困难,并且树脂成本较高,生产周期较长。王元凤采用离子交换树脂和吸附树脂对茶多糖进行脱色,筛选出大孔弱碱性的阴离子交换树脂D30 1一G和D315,非极性大孔吸附树脂D A20 1一C网。弱碱性树脂D EA E纤维素对茶多糖不仅具有脱色作用,而且可以去除茶多糖粗提物中的残余茶多酚,对茶多糖进行初步分级。双氧水的脱色原理是依赖它在水溶液中电离出的过氧化氢根离子 (H仇一)去进攻色素的结果。在酸性和碱性介质 中,能起漂白作用的H O离子浓度很
10、低,漂白作用很差,加入弱碱后,电离度增大,即双氧水被活化,漂白作用增强,分解速度加快。这是因为在此条件下,容易形成H o,而H O是一种亲核试剂,易引发过氧化氢分解,产生游离基,游离基一旦与茶叶中的色素作用,便可使之脱色。2.脱蛋 白法 李布青等证实茶多糖是一类与蛋白质结合在一起的酸性多糖或酸性搪蛋白,因此不能使用蛋白酶去除蛋白质,而且茶多糖中的游离蛋白质的碱性氨基酸会与多糖链上的酸性基团产生静电结合,使蛋白质和多糖联系更紧密网。一般常用的脱蛋白法有S eva g法、三氟三抓乙烷法和三氯乙酸 法。S ev ag法的条件较为温和,可避免多糖的降解,缺点是一次只能除去少量蛋白质,一般多次反复才能除
11、尽,多糖常溶解度相差较大的多糖,此方法适宜于分离各种溶解度相差较大的多糖。黄桂宽等用4 0%和6 0%的乙醇分级沉淀,干燥后得到浅黄色与灰白色的茶叶多糖T P一l和T P一2,得率分别为2 . 8 %和0 .7%圈。而季胺盐沉淀法是利用长链季胺盐能与酸性多糖形成水不溶性化合物,由此分离酸性及中性多糖,实验时必须严格控制多糖混合物的pH值小于8及无硼砂存在,否则中性多糖也会沉淀出来。一般来说,酸性强或分子量大的酸 性多糖首先被沉淀出来。常用的季胺盐是十六烷基三甲基澳化按(CT AB)及其碱(CT A一OH)和十六烷基毗吮(CP C)。4.超泣法分离超滤法是 2 0 世纪6 0年代兴起的一项膜分离
12、技术,它是利用不同孔径的超滤膜具有允许不同分子量和形状的物质通 过的性质,使样品溶液通过已知孔径的超滤膜从而得以分离。超滤法在分离过程中无相变,不添加任何化学试剂,加之超滤设备操作比较简单,滤膜可反复多次使用,现已广泛应用于果蔬汁加工、纺织印染及中药分离纯化领域l之卜利。超滤法既避免了制备过程中各成分的互相干扰,提高了各产品的纯度,又节约了处理成本,而且整个过程不引人有毒的有机溶剂,设备操作简便,极具工业应用前景网。K en i山i I曾用超滤法制备出纯化的茶多摊尸。寇小红等研究过0 .2卜m孔径膜后的茶汤滤液,再依次经过150 kD、2 0kD、6 kD的膜组件进行分级和浓缩,结果表明,膜超
13、滤分离处理对于茶多糖的分离纯化效果明显。茶汤中50 %以上的干物质能够透过20 kD的膜,并且20 kD膜截留液中的多糖含量最高,其 占干物质 的比重可达到 3 6.86 %,150 kD膜和6 kD膜截留部分 多糖含 量分 别为2 7.13%和2 1.16 %,而透过 6 kD膜部分茶多糖仅占干物质含量的1.的叹尸月。5.柱层析分离纯化经过脱色、脱蛋白,以及沉淀或超滤处理的茶多糖,大部 分杂质已经除去,但若要进一步分析茶多糖的组成、相对分子量、化学结构以及药理,还需要用柱层析对其进一步纯化分离。因为,一方面茶多糖中还可能残留少量杂质;另一 方面茶 多糖并不是均一组分,它是由多种分子量不同的组
14、分组成的。常用的柱层析有纤维素阴离子交换剂柱层析和凝胶柱层析。( l )纤维素柱层析。纤维素柱层析一般用D E AE一纤维素做交换剂,适合分离各种酸性、中性多糖和粘多糖,吸附力随多糖分子中酸性基团的增加而增加。江和源等用DEAE一5 2纤维素对脱色、脱蛋白后的茶多糖进行纯化,得到T邢1一H必、.TIS I一0 .2 5和T巧1刁.4 03个组分的茶多糖,对应洗脱液为H:o、o.2 5mo l/LNae l和0.4011101/L Naelp,!。(2)凝胶柱层析。凝胶柱层析是利用凝胶的分子筛作 用,根据多糖分子大小和形状的不同进行分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(S epha de x)、琼脂糖凝
15、胶( S e户a I Ds e)以及丙烯葡聚糖凝胶(S e汕a c娜)。这3种凝胶都有一系列分子量范围的产品,可以根据样品的分子量范围来选择相应的凝胶。汪东风等对S ev a g法脱蛋白后将茶多糖过S epha deG - -7 5 柱分离和 S epha deG - -巧0柱层析,液相检测显示其纯化所得的REEw e叨陀为单一对称峰,基本上为均一组分稗。寇小红等对过150 kD、20 kD、6 kD的超滤膜所得到的茶多糖的滤液和截留液再分别用D EAE一2纤维素离子交换剂柱层析和丙烯葡聚糖凝胶S e汕a c州S一30 0柱层析系统分离、纯化,共 得到了2 0多个茶多糖的分级组护习。多糖还可用
16、制备性高效液相层析、制备性区带电泳、亲和层析等其他方法纯化,这些方法有时对制备一些小量纯品供分析非常适用。虽然纯化多糖的方法很多,但是一种纯化方法往往只能除去其中一种或几种杂质,不能一次性得 到茶叶多糖均一性组分,而利用几种纯化方法结合可以达到较好的纯化效果。三、总结与展望茶多糖制备技术的研究与开发为茶多搪的结构分析、药理作用以及结构修饰等打下了基础。关于茶多糖的制备技术的研究报道很多,主要集中在微波、超声波、超滤等新技术的引进与技术条件的成熟化;多种提取技术和分离纯 化方法的搭配优化;与茶多酚制备技术、咖啡碱制备技术等技术的结合与综合运用等。综合来看,茶多糖单一某种提取方法或单一某种分离纯化方法都已比较成熟,但提取和分离纯化方法在搭配组合上还需要进一步优化,才能得出高得率、高纯度的茶多糖。目前,高纯度茶多糖的实验室制备 技术已经相对较成熟,但在大规模工业化生产中,由于工艺流程繁琐、生产成本过高与生产设备不配套,造成市场上销售的茶多糖纯度较低(一般在2 口%左右),并且制备过程中有机溶剂的大量使用,使茶多糖产品存在安全隐患,成为制约茶多糖相关
