质粒大抽试剂盒

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1、 质粒大量抽提试剂盒质粒大量抽提试剂盒 产品编号 产品名称 包装 D0026 质粒大量抽提试剂盒 20次 产品简介：产品简介： ? 碧云天的质粒大量抽提试剂盒(Plasmid Maxi Preparation Kit)是一种用于从大肠杆菌中进行大量质粒的快速抽提的试剂盒。 ? 本试剂盒采用了一种新型的离子交换柱。在特定条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条 件下又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，6个样品只需不足90分钟即可完 成。 ? 两步过柱纯化，使质粒纯度进一步提高，达到转细胞级要求。 ? 每个质粒纯化柱可以结合的质粒量的上限

2、大于500微克。每个纯化柱可用于抽提100毫升左右用LB培养过夜的大肠杆菌。 抽提所得质粒的OD值一般在1.80左右。抽提获得的质粒量会受质粒拷贝数等因素影响。抽提获得的质粒DNA的OD值也 会因菌种不同等原因而略有波动。 ? 由本试剂盒所得质粒可直接用于转染细胞，DNA测序，PCR，基于PCR的突变，体外转录，转化细菌，内切酶消化等。 本试剂盒抽提的含Firefly luciferase 或Renila luciferase报告基因的质粒，用Lipofectmine 2000或Fugene 6转细胞，报告基因 检测结果表明仅0.5微克受SV40启动子控制的质粒转化12孔板内的一孔原代贴壁细胞

3、，总RLU值约为五百万，测定时间为 10秒。 ? 内毒素(endotoxin)含量低。用对内毒素敏感的细胞转染受内毒素响应的报告基因质粒，与Qiagen昂贵的Endotoxin Free大抽 试剂盒相比，检测结果完全一致。 包装清单：包装清单： 产品编号 产品名称 包装 D0026-1 溶液I (悬浮液) 105ml D0026-2 溶液II(裂解液) 105ml D0026-3 溶液III (结合液) 150ml D0026-4 溶液IV (洗涤液) 84ml3 (第一次使用前每瓶加入126ml无水乙醇) D0026-5 溶液V (洗脱液) 90ml D0026-6 溶液VI (DNA纯化结

4、合液) 210ml D0026-7 RNase A (100mg/ml) 105l 大抽质粒纯化柱 20个 废液收集管 20个 说明书 1份 保存条件：保存条件： 室温保存，一年有效。 注意事项：注意事项： ? 第一次使用前把试剂盒提供的第一次使用前把试剂盒提供的RNase A全部加到溶液全部加到溶液I (悬浮液悬浮液)中，混匀，并在瓶上做好标记。加入中，混匀，并在瓶上做好标记。加入RNase A后4存放。后4存放。 ? 第一次使用前在每瓶溶液第一次使用前在每瓶溶液IV (洗涤液洗涤液)中加入中加入126ml无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。 ? 温度较低时，

5、溶液II和溶液III可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀，37水浴加热溶解，混匀后使用。溶 液II请勿过分剧烈混匀，否则会产生大量气泡。 ? 溶液II使用完后，一定要盖紧瓶盖，防止被空气中二氧化碳酸化。 ? 溶液II有强碱性，溶液II、溶液III和溶液VI对人体都有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护。 ? 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。 ? 废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。 ? 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明：使用说明： 1. 取过夜菌至取过夜菌至50毫升离心管内，毫升离心管内，5000g离心离心

6、1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。毫升过夜菌沉淀。 通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清，再 倒入约50毫升菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。如果细菌密度明显偏低，可考虑 使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量每管一般不能超过150毫升，对于低拷贝质粒所用菌量

7、每管一般不能超过200毫升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。 2. 每管加入每管加入5毫升溶液毫升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。 确认溶液I中已添加了RNase A。最高速度vortex 10-20秒或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈 均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开。 3. 每管加入每管加入5毫升溶液毫升溶液II，轻轻颠倒离心管，轻轻颠倒离心管4-6次，室温放置次，室温放置3-5分钟，使细菌完全裂解，溶液透明。分钟，使细菌完全裂解，溶液透

8、明。 切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后，溶液 应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。遇到 有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，但总裂解时间不可超过5分钟。 4. 每管加入每管加入5毫升溶液毫升溶液III，随即颠倒离心管，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。次混匀，可见白色絮状物产生。 切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。 5. 最高速最高速(5,000rpm)室温离心室温离

9、心10-20分钟。分钟。 如果速度较高例如10,000rpm左右，一般离心10分钟已经足够。离心更长时间例如20分钟，会使沉淀更加紧密，更集中于 管底，对于进一步提高质粒质量会有所帮助。速度较低时必须适当延长离心时间，使沉淀更加充分。离心时可以准备好 质粒纯化柱，自制漏斗等，并在纯化柱上标上记号。 6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心2分钟，倒弃收集管内液体。分钟，倒弃收集管内液体。 质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。 7. 在质粒纯化柱内加入在质粒纯化柱

10、内加入7毫升溶液毫升溶液IV，最高速离心，最高速离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体。分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体。 加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。 8. 最高速再离心最高速再离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。 注意：注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。 9. 将质粒纯化柱置于将质粒纯化柱置于50毫升离心管上，加入毫升离心管上，加入2毫升溶液毫升溶液V至管内柱面上，放置至管内柱面上，放置2分钟。分钟。 也可以用重蒸水或 MiliQ级

11、纯水替代溶液 V，但是水的 pH应不小于 6.5。溶液 V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产 量会略有帮助。 10. 最高速离心最高速离心2分钟，所得液体中加入分钟，所得液体中加入10毫升溶液毫升溶液VI，混匀后加到原质粒纯化柱内。，混匀后加到原质粒纯化柱内。 加入溶液VI后必须混匀！可颠倒混匀，混匀后切勿离心。 11. 最高速离心最高速离心2分钟，倒弃收集管内液体。分钟，倒弃收集管内液体。 12. 在质粒纯化柱内加入在质粒纯化柱内加入15毫升溶液毫升溶液IV，最高速离心，最高速离心2分钟，进一步洗去杂质，倒弃收集管内液体。分钟，进一步洗去杂质，倒弃收集管内液体。 加入溶液IV后可以不用等待，

12、直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。 13. 最高速再离心最高速再离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。 注意：注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。 14. 将质粒纯化柱置于将质粒纯化柱置于50毫升离心管上，加入毫升离心管上，加入2毫升溶液毫升溶液V至管内柱面上，放置至管内柱面上，放置2分钟。分钟。 也可以用重蒸水或MiliQ级纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会 略有帮助。如想得到较高浓度的质粒，可以加入1.3毫升溶液V洗脱。 15. 最高速离心最高速离心2分钟，所得液体即为转细胞级超纯质粒。分钟，所得液体即为转细胞级超纯质粒。 通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml左右。如果想得到高浓度的质粒，可以采用常规的乙醇沉淀方法浓缩质粒。