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1、高效液相色谱同时测定鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留刘 媛 谢孟峡3丁 岚单吉浩 杨清峰 刘素英(北京师范大学分析测试中心,北京100875)(农业部畜禽产品质量监督检验测试中心,北京100026)摘 要 建立了固相萃取2反相高效液相色谱同时分析鸡蛋样品中4种氟喹诺酮类药物残留量的方法。对鸡蛋样品的提取及其在C18固相萃取柱上的净化条件进行了研究,采用高效液相色谱分离,荧光检测器检测(ex= 280 nm ,em= 450 nm) ,外标法定量。4种沙星标准曲线的线性回归系数均在0. 9999以上,环丙沙星、 恩诺沙星、 沙拉沙星的线性范围为2. 5500g/L ;达诺沙星为0. 5100g/L。
2、鸡蛋样品中4种沙星的加标回收率为78. 1 %95. 7 %;相对标准偏差为4. 1 %16. 2 %。环丙沙星、 恩诺沙星、 沙拉沙星的最低检出限为10g/ kg;达诺沙星的最低检出限为2g/ kg。关键词 环丙沙星,达诺沙星、 恩诺沙星、 沙拉沙星、 固相萃取、 高效液相色谱、 鸡蛋2003204205收稿;2003210225接受1 引 言氟喹诺酮类药物主要用来预防和治疗动物疾病1 ,2,少量使用对动物具有一定的促进生长作用,但过量使用或使用不当会导致畜产品中药物残留。因该类药物对人体中枢神经系统会造成不良反应3, 所以欧盟、 北美等国家规定:种动物源食品中的最高残留限量不得超过1040
3、0g/ kg。氟喹诺酮类药物的常规测定方法主要有反相2高效液相色谱法6 ,7、 分光光度法8、 荧光法9、 薄层色谱法10等。固相 萃取2反相高效液相色谱方法已经成功地应用于可食性动物组织11 ,12、 动物血液13以及人血浆、 人尿液14等体系中的药物残留分析。但是蛋及蛋制品中环丙沙星、 达诺沙星、 恩诺沙星和沙拉沙星残留量 检测方法在国内仍处于空白。本实验研究了鸡蛋中环丙沙星、 达诺沙星、 恩诺沙星和沙拉沙星4种氟喹诺酮类药物残留的液相色谱 2荧光检测器分析方法,建立了固相萃取-液相色谱分析鸡蛋样品中4种氟喹诺酮类药物残留量的方法。2 实验部分2. 1 仪器与试剂510 HPLC Pump
4、液相色谱仪(美国Waters公司) ,六通阀进样器,810色谱工作站;荧光检测器:Waters 470E Scanning Fluorescence Detector ;色谱柱:Inertsil ODS23 5m 250 mm4. 6 mm;C18固相萃取柱:VARIAN BOND ELUT C18 ,200 mg ,3 mL。 环丙沙星、 达诺沙星、 恩诺沙星和沙拉沙星(中国兽 药监察所,含量均大于99. 0 %) ;乙腈(色谱纯,美国Fisher公司) ;其它试剂均为国产分析纯。实验用水为MilliQ高纯水。2. 2 鸡蛋样品的处理 将约300 g鸡蛋打碎,蛋清和蛋黄搅拌均匀,置于- 20
5、 冰箱中保存。准确称取2 g匀浆后的鸡蛋样品置于50 mL离心管中,加入20 mL组织提取液(0. 1 mol/ L磷酸盐缓冲液,pH 7. 0) ,涡旋震荡混合, 于4000 r/ min下离心10 min。将上清液全部转移到另一离心管中,加入20 mL水饱和的正己烷,涡旋 震荡,4000 r/ min下离心10 min ,弃去上层。在下层溶液中再加入20 mL水饱和的正己烷,同样震荡、离心,用吸管将上层溶液仔细吸净。下层为固相萃取上样液。2. 3 液相色谱分离条件流动相:乙腈0. 05 mol/ L磷酸/三乙胺缓冲液(pH 2. 4) = 1981 ;荧光检测波长:ex= 280 nm ,
6、em=450 nm;流速:1. 0 mL/ min ;进样量:20L。第32卷2004年3月分析化学(FENXI HUAXUE) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry第3期3523552. 4 标准溶液的配置及标准曲线 准确称取环丙沙星、 恩诺沙星、 沙拉沙星和达诺沙星标准品用0. 03 mol/ L的NaOH溶液溶解并定 容。依次用超纯水稀释成环丙沙星、 恩诺沙星、 沙拉沙星的浓度分别为2. 5、5. 0、10、50、100、500g/ L , 相应达诺沙星浓度为0. 5、1、2、10、20、100g/ L的一系列标准溶液。液相色谱测定,以各
7、组分的色谱峰面积对浓度作线性回归得定量标准曲线。2. 5 重复性及加标回收实验 称取约2 g匀浆后的鸡蛋样品,在其中分别加入一定量的4种沙星混合溶液,然后再加入20 mL组 织提取液进行提取,固相萃取净化和高效液相色谱定量分析。图1 4种沙星标准溶液高效液相色谱分离图Fig. 1 Chromatogram of standard solution of the fourfluoroquinolones3 结果与讨论3. 1 液相色谱分离 由于沙星为两性化合物,在流动相中加入三乙 胺可以消除硅羟基的影响,并将流动相的pH调至214以抑制解离,改善峰形。4种沙星的标准溶液(环丙沙星、 恩诺沙星和沙
8、拉沙星的浓度为50g/ L ,达诺沙星的浓度为10g/ L)的色谱分离图见图1。3. 2 待测组分的日内稳定性4种沙星的标准混合溶液,环丙沙星、 恩诺沙星、 沙拉沙星浓度为10g/ L ,达诺沙星为2g/ L ,在8 h之内进针7次以考察样品的日内稳定性,4种沙星色 谱峰面积的相对标准偏差均在2 %以内。3. 3 标准曲线以进样前浓度对组分色谱峰面积作图,得到4种沙星的标准曲线。其线性方程和线性回归系数见表1。环丙沙星、 恩诺沙星、 沙拉沙星的线性范围分别为2. 5500g/ L ;达诺沙星的线性范围为0. 5100g/ L。表1 标准曲线方程及线性回归系数 Table 1 The linea
9、r equations and regression coefficients of the standard curves样品 Sample线性方程 Linear equations回归系数 Regression coefficients样品 Sample线性方程 Linear equations回归系数 Regression coefficients 环丙沙星 CiprofloxacinA= 547.7C- 91. 40. 99997达诺沙星 DanofloxacinA= 5336.8C- 122. 10. 99997恩诺沙星 EnrofloxacinA= 1162.9C- 50. 60.
10、 99997沙拉沙星 SarafloxacinA= 372.8C+ 88. 60. 999903. 4 固相萃取条件的优化由于鸡蛋中含有大量的脂类、 蛋白质及氨基酸等干扰组分,样品的提取液呈浑浊状态,若直接上样到固相萃取柱,不但净化效果不理想,而且会造成柱子的堵塞。所以在上样前必须对提取液进行预处理,用正己烷萃取两次可以基本上去除提取液中的脂类成分,有利于进一步的固相萃取净化。本实验采用C18反相固相萃取柱,首先采用5 mL乙腈活化柱子,为了使柱子有一个和上样液、 淋洗条件相匹配的环境,再依次选用5mL 30 %乙腈20. 05 mol/ L磷酸/三乙胺缓冲液和5 mL组织提取液对固相萃取柱进
11、行活化。在实验中上样体积、 淋洗体积和样品洗脱溶剂的强度都是影响净化效果和回收率的重要因素15。分别实验了5、10和15 mL 3种上样体积时的回收率。上样5 mL和10 mL所得到的回收率基本相当,而当上样体积增加到15 mL之后,4种沙星的回收率分别降低了6. 1 %15. 0 %。2和3 mL水淋洗的净化效果相当,但当淋洗体积增加到5 mL之后环丙沙星的回收率有所降低。分别用含有20 %、30 %、50 %和80 %乙腈的0.05 mol/ L磷酸/三乙胺缓冲液作为洗脱溶剂,发现当使用353第3期刘 媛等:高效液相色谱同时测定鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留 30 %的乙腈磷酸盐缓冲体系洗脱
12、时,1 mL的洗脱体积,各种沙星的回收率已经能够达到82.0 %9517 %。 最佳的固相萃取净化条件为:依次用5 mL乙腈、5 mL 30 %乙腈20. 05 mol/ L磷酸/三乙胺缓冲液 和5mL组织提取液活化柱子;将鸡蛋提取并经过两次正己烷净化后的溶液上样10 mL ;2 mL水淋洗, 最后用1 mL 30 %乙腈20. 05 mol/ L磷酸/三乙胺缓冲液洗脱。经过固相萃取净化浓缩后的鸡蛋空白样品和鸡蛋加标样品(加标量为环丙沙星、 恩诺沙星、 沙拉沙星50g/ kg ,达诺沙星10g/ kg)的液相色谱 图见图2、 图3。 从图2、 图3可以看到,用上述方法对鸡蛋样品的净化处理后,影
13、响4种沙星定量测定的干扰组分 被完全去除。图2 鸡蛋空白样品的液相色谱图Fig. 2 Chromatogram of the drug2free egg sample图3 4种氟喹诺酮类药物加标的鸡蛋样品高效液相色谱图Fig. 3 Chromatogram of egg fortified with four fluoro2quinolones3. 5 鸡蛋样品中4种沙星的检出限分别在鸡蛋中加入不同量的标准品,经过提取 和固相萃取净化富集,应用高效液相色谱定量测定4种沙星样品在鸡蛋中的加标回收率,结果见表2。表2 不同加标浓度氟喹诺酮药物在鸡蛋样品中的回收率 Table 2 The recov
14、eries of four fluoroquinolones in eggs fortified with different concentrations样品 Sample加标浓度(g/ kg) Concentration fortification平均回收率( %) Average Recovery测定次数 Determination times相对标准偏差 RSD ( %)环丙沙星 Ciprofloxacin5 10 2585. 7 79. 1 85. 58 6 415. 8 10. 0 5. 6达诺沙星 Danofloxacin1 2 589. 3 78. 1 82. 08 6 410
15、. 8 8. 0 5. 7恩诺沙星 Enrofloxacin5 10 2586. 9 82. 2 95. 78 6 49. 8 8. 7 4. 1沙拉沙星 Sarafloxacin5 10 2585. 8 80. 8 95. 08 6 416. 2 12. 1 7. 9表2中的加标浓度是指在每kg鸡蛋中加入药品的量,4种沙星在3个浓度的加标回收率均在7811 %95. 7 %之间;相对标准偏差均在20 %以内。因在检出限的1/ 2和2. 5倍的回收率及重复性符 合微量残留物检测的要求,所以鸡蛋中的环丙沙星、 恩诺沙星和沙拉沙星的检出限为10g/ kg;而达诺 沙星的检出限则可达到2g/ kg。
16、3. 6 批内批间重复性 应用所建立的方法测定了不同来源的4批阴性鸡蛋样品的加标回收率(加标量为环丙沙星、 恩诺沙 星、 沙拉沙星50g/ kg;达诺沙星为10g/ kg)。样品平行测定6次,各批次的平均加标回收率均在83.6 %94. 8 %之间,批内和批间的相对标准偏差见表3。回收率的最大相对标准偏差小于10 %。453 分 析 化 学第32卷表3 批内批间的重复性 Table 3 Reproducibility of intra2assay and inter2assay 环丙沙星 Ciprofloxacin ( %)达诺沙星 Danofloxacin ( %)恩诺沙星 Enrofloxacin ( %)沙拉沙星 Sarafloxacin ( %)批内Intra2assay5. 83. 21. 78. 6 批间Inter2assay6. 36. 25. 99. 2References1 Kung K.J.Vet.P
