抗菌药物体外敏感试验抗菌药物体外敏感试验 主要内容主要内容 抗菌药物体外敏感实验 耐药机制检测及2010年CLSI主要变化的解读 WHONET的基本使用 测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Test），简称药敏试验（AST） 药敏试验的目的药敏试验的目的 帮助临床医师选用效果最佳的药物治疗感染性疾病 监测细菌耐药性变迁，进行流行病学追踪，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行，并为临床经验用药提供依据 药敏选择标准 CLSI规则 细菌： 肠杆菌科、铜绿假单胞菌、葡萄球菌属、肠球菌属和不 动杆菌属、洋葱伯克霍尔德菌、嗜麦芽窄食单胞菌、其他 非肠杆菌科细菌（MIC） 嗜血杆菌属、淋病奈瑟球菌、肺炎链球菌、 α -、β-溶 血性链球菌 A组 为常规的一级试验组合并常规报告结果 B组 亦可用于一级试验，但应选择性报告，即当A组药 物耐药时可以选择性地报告B组中的同类药物 C组 为补充性药物，可选择性报告 U组 主要用于治疗尿路感染的选择用药 常用的常用的药敏试验方法药敏试验方法 纸片扩散法 稀释法 E试验 纸片扩散法（纸片扩散法（Kirby-Bauer法）法） 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小 水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.2～7.4，做成琼脂厚度4mm，直径90mm的平板 挑取孵育16-24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准 用无菌棉拭子蘸取菌液，在 试管内壁旋转挤去多余菌液 然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次， 每次旋转平板60度 最后沿平板内缘涂抹1周 平板在室温下干燥3～5分钟，用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘大于15mm 8. 35℃孵育16～24小时量取抑菌圈直径 9. 根据抑菌环的直径，按照CLSI标准判读，报告敏感、中介、耐药 以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培养后观察其最低抑菌浓度 稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培养基者为肉汤稀释法 稀释法稀释法 表表7 7- -1 1 常用抗菌药物容积稀释法常用抗菌药物容积稀释法 步骤 浓度 （mg/mL） 来源 体积 (mL) CAMHB (mL) 最终浓度（ mg/mL） 1 5120 储存液 1 9 512 2 512 步骤1 1 1 256 3 512 步骤1 1 3 128 4 512 步骤1 1 7 64 5 64 步骤4 1 1 32 6 64 步骤4 1 3 16 7 64 步骤4 1 7 8 8 8 步骤7 1 1 4 9 8 步骤7 1 3 2 10 8 步骤7 1 7 1 11 1 步骤10 1 1 0.5 12 1 步骤10 1 3 0.25 13 1 步骤10 1 7 0.125 目前有许多厂家生产商品化的微量抗生素敏感试验板，用低温冷冻干燥，真空包装，保存在2-8 ℃，保质期12个月。
①生产厂商可以根据用户要求包被药物； ②制备0.5麦氏菌液，然后1:200稀释，使之最终浓度5×105 CFU/ml，每孔加入100ml ，过夜孵育后，不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对试验菌的最低抑菌浓度（MIC） E E试验试验 E试验结合了稀释法和扩散法的原理和特点 方法是将抗菌药物放置于5mm×50mm 的不透明薄型塑料带上，药物浓度成梯度递减塑料带的反面是相应的药物浓度标记 菌液制备及接种均同纸片扩散法 90mm平板上可放E试验试条1-2条，140mm平板最多可放6条 孵育温度及时间同纸片扩散法 孵育后围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，抑菌圈和试条的横向相交处的刻度读数为该抗菌药物对测试菌的最低抑菌浓度（MIC），（MIC的读取应参照厂家的说明书） 常见耐药机制的表型检测常见耐药机制的表型检测 甲氧西林耐药的葡萄球菌（MRS） 超广谱β-内酰胺酶（ESBLs） 万古霉素耐药肠球菌（VRE） 高水平氨基糖苷类药物耐药的肠球菌（HLARE） 青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP） 肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶的检测 甲氧西林耐药的葡萄球菌甲氧西林耐药的葡萄球菌 （（MRSMRS）） MRS检测 药物 纸片法 稀释法 金黄色葡萄球菌 1mg 苯唑西林 √ √√ 路邓葡萄球菌 1mg 苯唑西林 ×× √√ 金黄色葡萄球菌和路邓葡 萄球菌 30mg 头孢西丁 √ √√ 除路邓以外的凝固酶阴性 葡萄球菌 1mg 苯唑西林 ×× √√ 30mg 头孢西丁 √ ×× 金葡中万古霉素的检测金葡中万古霉素的检测 CLSI2009 CLSI2010 CLSI2010葡萄球菌变化葡萄球菌变化 CLSI2009 CLSI2010 CLSI2010葡萄球菌变化葡萄球菌变化 CLSI2009 CLSI2010 CLSI2010葡萄球菌变化葡萄球菌变化 增加增加 MRSA的定义的定义 MRSA就是金葡的某些菌株表达mecA基因或是其他耐 甲氧西林机制，比如与青霉素结合蛋白亲和力的改变 关于关于mecA阴性阴性MRSA 机制 —修饰青霉素结合蛋白位点(PBPs) 1,2,4 (MOD -SA) —编码blaZ的青霉素酶过度表达 —Methicillinase ● 罕见 ● 文献里有限的临床资料 re: 有关β-内酰胺类药物的治疗 Croes, S et al. 2009. Clin Microbiol Infect. Epub. 10/09 Chambers, H. 1997. Clin Microbiol Rev. 10:781. OX CX 耐药机制 流行率 报告- OX S S 无 普遍 S R R mecA 普遍 R R S mecA(低水平表达) 不常见 R﹡ S R PBP改变或是大量β-内 酰胺酶（近似MRSA） 罕见 R﹡ 超广谱超广谱β-内酰胺酶内酰胺酶（（ESBL）） 纸片法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL （筛选阳性）： • 头孢泊肟≤17mm • 头孢他啶≤22mm • 头孢噻肟≤27mm • 头孢曲松≤25mm • 氨曲南 ≤27mm 超广谱超广谱β-内酰胺酶（内酰胺酶（ESBLs）） 纸片法（表型确认试验）。
头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸 任一复方制剂的抑菌圈直径与相应单药抑菌圈直径相差≥5mm时，即可判断该菌产ESBL 超广谱超广谱β-内酰胺酶（内酰胺酶（ESBLs）） 稀释法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL： • 头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲南MIC≥2mg /mL • 或头孢泊肟MIC≥8mg /mL 超广谱超广谱β-内酰胺酶（内酰胺酶（ESBLs）） 稀释法（表型确认试验） 头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸 任何一组酶抑制剂复方制剂的MIC值比相应单药的MIC降低3个稀释度者即可判定该菌为产ESBL菌株 检测检测ESBLs 目的 如果使用…… 旧的折点 M100-S19 修正过的折点 M100-S20 用于临床报告用于临床报告 ESBL筛选和确证实验 Yes No 把头孢菌素类，青霉素类，氨曲南 由“S”改为“R” Yes No 用于感染控制用于感染控制 ESBL筛选和确证实验 Yes(如果要求 做…..) Yes（如果要求 做…..) 把头孢菌素类，青霉素类，氨曲南 由“S”改为“R” Yes No 肠杆菌科肠杆菌科 折点已修正折点已修正(MIC µg/ml) 药物 CLSI M100-S19 2009 CLSI M100-S20 2010 S I R S I R 头孢唑啉 =32 =4 头孢噻肟 =64 =4 头孢唑肟 =64 =4 头孢曲松 =64 =4 头孢他啶 =32 =16 氨曲南 =32 =16 CLSI M100 -S20. Table 2A. 肠杆菌科折点修正肠杆菌科折点修正 (纸片法纸片法 mm) 药物 CLSI M100-S19 2009 CLSI M100-S20 2010 S I R S I R 头孢唑啉 >=18 15-17 =23 15-22 =26 23-25 =20 15-19 =25 22-24 =21 14-20 =23 20-22 =18 15-17 =21 18-20 =22 16-21 =21 18-20 <=17 检测检测ESBLs 现在我们认识到： ●ESBLs表型检测不是最理想的 1：在做确证实验时，多重耐药机制的出现会掩盖ESBLs 例如 -ESBLs+AmpC -ESBLs+porin mutation 2:ESBLs出现在除E.coli，Klebsiella spp.，Proteus mirabilis之外的其他肠杆菌科细菌某些种时确证实验并不可行。
3：一些实验室不做检测 ●相对于耐药机制的认识，MIC与统计输出结果关系更密切 Kohner Kohner et al. 2009. J Clin Microbiol. 47:2419. 肠杆菌科细菌肠杆菌科细菌 ----------碳青霉烯酶的检测碳青霉烯酶的检测 碳青霉烯酶筛选及确认实验碳青霉烯酶筛选及确认实验 1、当实验室检测到菌株对碳青霉烯类药物中介或者耐药时，只需要按照实际检测结果报告临床，没必要进行改良Hodge试验（医生通常不会选用“I”或“R”的药物） 2、改良Hodge试验对感染控制和流行病学调查用处极大 纸片筛选法： 选用厄他培南、美罗培南筛选；亚胺培南不作为碳青霉烯酶筛选药物 筛选实验 肠杆菌科碳青霉烯敏感及肠杆菌科碳青霉烯敏感及 碳青霉烯酶筛选的折点碳青霉烯酶筛选的折点 ＊亚胺培南不用于变形/普罗威登/摩根菌属中碳青霉烯酶的筛选因为这些菌属会产生非碳青霉烯酶导致的亚胺培南MIC升高 ＊＊NA：不可用（本试验不适用于筛查） 标准的标准的CLSICLSI”S S”折点折点 “S”范围内建议检测碳青范围内建议检测碳青 霉烯酶的筛选值霉烯酶的筛选值 药物药物 厄他培南厄他培南 亚胺培南＊亚胺培南＊ 美洛培南美洛培南 什么时候做改良什么时候做改良Hodge试验？试验？ 如果头孢噻肟，头孢他啶， 和 /或头孢曲松耐药。
注：头孢比肟对于碳青 霉烯酶产生株的结果是 不稳定的 和和 MIC 抑菌圈抑菌圈 （（μg/ml) (mm) 厄他培南厄他培南 2 19-21 亚胺培南亚胺培南＊＊ 2-4 NA ＊＊＊＊ 美洛培南美洛培南 2-4 16-21 做改良的Hodge试验 （确证试验） ＊亚胺培南不用于对于变形/普罗威登/ 摩根菌属的筛选 ＊＊NA：不可用（本试验不适用于筛查） 改良改良Hodge试验试验 ATCC 25922 厄他 培南 阳 性 1.ATCC25922配成0.5麦氏浊度，1：10稀释； 2.用棉签涂布菌液于MH平板上， 中心贴一张厄他培南或美洛培南纸片； 3.取待测菌从纸片边缘向外划； 4.培养过夜； 5.大肠沿着菌株划线的生长表明碳青霉烯水解酶的产生 改良改良Hodge试验试验 不确定 阴性 细菌耐药监测软件细菌耐药监测软件 WHONET系统的基本应用系统的基本应用 主要内容主要内容 软件安装 实验室设置 新建实验室 数据输入 数据分析 WHONE。