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1、凯氏定氮法测定食品中蛋白质的探讨 Kjeldahl Determination of Protein in Food Discussion万凌燕(贵州省六盘水市质量技术监督检测所, 贵州 六盘水 553001)摘 要: 对用凯氏定氮法测定食品中蛋白质在取样、 消化、 滴定等环节中应注意的事项作了总结和理论分析。关键词: 凯氏定氮法; 食品; 蛋白质; 探讨蛋白质含量的测定是评价食品质量的重要指标。蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法, 它是测定总有机 氮最准确和最简单的方法之一, 迄今被作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法中测定蛋白质的方法有取样、 样 品消化、 蒸馏、 滴定 4个步骤, 其原理较
2、为复杂, 使用的试剂也比较多。笔者经过几年的试验总结出以下几点: 1 取样由于食品种类繁多, 形态及含氮量不一, 因此取样应 均匀, 称样量应准确合理。对取样较困难的半固体( 如冰淇淋) 可置于已记重的纸片上称重( 样品重= 总重 ) 纸片 重) , 样品称好后, 与纸片一起置于凯氏烧瓶底部。为减少系统误差可于空凯氏烧瓶中同时投入相同规格的纸片 一张同时作空白。对于不同含氮量的食品, 为保证终点滴定消耗酸的体积数在有效范围, 取样量应视样品含氮 量而定, 一般含量在 5% 20%的应精确称取( 110 210)g( 如糕点等) ; 对含量在 011% 110% 的应相应增大取样 量, 以( 5
3、10 1010) g 为宜( 如淀粉等) ; 对于高含量的( 蛋白质大于 30%) 的应减少取样量, 以( 012 110) g 为宜( 如大豆粉等) 。 2 消化样品消化要彻底、 完全、 无损失, 这个步骤需注意浓 硫酸的用量和催化剂的使用。211 浓硫酸的作用及用量 样品在消化时加入浓硫酸主要作用有五个: 一是脱水作用, 将样品中的碳水化合物中的水分脱去; 二是氧化 作用, 浓硫酸和硫酸钾、 硫酸铜一同加热使温度达到400e 以上, 浓硫酸分解将样品中的 CO2和H2O 除去; 三是分解作用, 将蛋白质分解, 使氮最终生成 NH4+; 四是吸收作用, 生成的NH4+与浓硫酸反应生成( NH
4、4)2SO4; 五是生成的(NH4)2SO4保存在浓硫酸溶液中不易损失。但浓硫酸的用量很难用理论计算确定, 实际工作中, 浓硫酸 的用量, 既要将样品中的 C、 H 全部氧化除去, 将蛋白质中的氮转化为硫酸铵, 又要使消化液中有过量的硫酸存 在, 使硫酸铵在强酸性溶液中不易分解, 因此浓硫酸必须过量。当样品用量增加或糖分、 脂肪含量较高时, 浓硫酸的用量也应相应增加。 212 催化剂的使用在消化反应中, 为了加速蛋白质的分解, 缩短消化时 间, 常加入催化剂。凯氏定氮法中加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物分解, 它与硫酸作用生成的硫 酸氢钾可以提高反应温度达 400e 以上。反应式如下:
5、K2SO4+ H2SO42KHSO42KHSO4K2SO4+ SO2+ H2O硫酸钾的加入量应视其样品含糖、 脂肪、 蛋白量而 定, 它们的关系成正比, 加少了, 温度低, 消化时间长, 但也不能加得太多, 否则消化体系温度过高, 会引起硫酸铵 分解, 反应式如下:( NH4)2SO4NH3+ ( NH4) HSO42( NH4) HSO42NH3+ 2SO2+ 2H2O 硫酸铜的作用一是加速反应, 二是在下一步蒸馏时作碱性反应的指示剂。213 当样品脂肪、 糖含量较高时, 可在消化前加入硫酸 铜、 硫酸钾、 硫酸, 同时加入几滴过氧化氢、 少量辛醇、 硅油或液体石蜡摇动, 待气泡消失后再消化
6、。在消化终点, 不易得到澄清溶液时, 可将定氮瓶取下放冷后, 缓缓加入30%过氧化氢( 2 3)mL, 促进消化。 3 蒸馏消化液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨, 所以加 入氢氧化钠的量和吸收液的温度很关键。除此之外, 蒸馏装置的气密性也很重要。311 40%氢氧化钠溶液的作用 在蒸馏时加入浓度为 40% 氢氧化钠溶液, 其作用是中和样品消化后剩余的浓硫酸; 使烧瓶内的溶液呈强碱性。因为在强碱性条件下, ( NH3)2SO4转化为NH4OH, 经加热使 NH3逸出, 被硼酸吸收。反应式如下:( NH4)2SO4+ 2NaOH2NH3+ Na2SO4+ 2H2O89万凌燕: 凯氏定氮法测定食品中
7、蛋白质的探讨面筋测定仪：h t t p : / / w w w . h z m z 1 7 . c o m /NH3+ H3BO3NH4+ H2BO3-312 40% 氢氧化钠溶液用量的确定为使 样 品消 化 液 中的 ( NH4)2SO4全 部 转 化 为 NH4OH, 40%氢氧化钠溶液必须加入过量。用量不够会造成测定结果偏低, 用量过多会造成试剂的浪费。40% 氢氧化钠溶液加入量的计算依据是样品消化时浓硫酸的 加入量, 在完全中和剩余浓硫酸的基础上, 再过量 40% ,使蒸馏烧瓶内的氢氧化钠溶液的浓度保持在 019mol/ L 110mol/ L。 313 硼酸吸收液的温度不应超过40e
8、 , 否则对氨的吸收作用减弱而造成损失, 此时可置于冷水浴中。 4 滴定 滴定是整个实验过程中的最后一个步骤。关键的环节是控制好滴定的速度, 观察滴定过程中溶液的颜色变 化, 本文中采用的是 1 份甲基红乙醇溶液与 5 份溴甲酚 绿乙醇溶液临用时混合。当溶液的 pH 610 时呈现蓝绿色。根据 滴定理论分析, 用盐酸标准溶液滴定接收液( 四硼酸铵水 溶液) 完全中和时 pH 为 511, 指示剂颜色发生突变, 由蓝绿色变为灰色以指示滴定终点的到达。但从蓝绿色至灰 色是一个颜色逐渐变化的过程, 不易观察, 而是观察溶液蓝绿色消失刚变红为滴定终点。当溶液 pH 达 5. 1 时稍微过量的盐酸标准溶
9、液约 0102mL 即可使溶液呈现淡砖 红。溴甲酚绿一甲基红混合指示剂的配方有好几种, 但 以 5份 011%溴甲酚绿乙醇溶液和1 份011%甲基红乙醇溶液混合而成的变色比较敏锐。在常量凯氏定氮法中, 滴定终点由蓝绿色消失刚变红色, 而在半微量和微量凯 氏定氮法中则为蓝色刚好消失即为滴定终点。如以 pH计对滴定终点进行判定更为准确。 5 结束语 凯氏定氮法测定蛋白质中从取样、 样品消化、 蒸馏、 滴定, 各种书本上介绍的试剂加入量等差别较大, 有的比较古 老但一直沿用,存在试剂使用不合理的现象。通过实践、 比 较、 分析,以国家标准规定的检验方法最为合理、 严谨。参考文献 1 王叔淳. 食品卫
10、生检验技术M . 北京: 化学工业出版社, 1988. 2GB5009 15- 20105食品安全国家标准食品中蛋白质的测定6. 3 靳敏, 夏玉宇. 食品检验技术. 北京: 化学工业出版社,2003. 4 美S1Suzanne Nielsen 杨严俊1 食品分析( 第二版) . 北京: 中国轻工业出版社, 2002.作者简介: 万凌燕, 女, 工程师。工作单位: 六盘水市质量技术监督检测所。通讯地址: 553001 贵州省六盘水市钟山区八一路四十八号。收稿日期: 2012- 03- 28( 上接第 88页)算术平均值 x = 201008, 单次实验标准差:s=Eni= 1(xi- x)2n
11、- 1= 01002( mA) = 2mA在实际测量中, 取该检定点的最大值作为该点的测 量误差, 所以 u(I2)= S= 2mA 自由度 v22= n- 1= 9 由于 u( I1)和 u(I2)相互独立, 因此u(I)=u2( I1)+ u2( I2) = 3147mA 自由度 v2= 69 4 不确定度汇总表( 见表 1) 表1不确定度来源u(xi)| ci| ciu(xi)|vi输入量P 的标准不确定度分量1 173KPa4L A/KPa6192 LA200智能数字压力校验仪压力测量1 173 KPa输入量 I 的标准不确定度分量3147L A13147 LA69 智能数字压力校验仪
12、电流测量2183L A2183 LA200 测量重复性2L A2L A95 合成标准不确定度uc( $ I) =u2( P)+ u2(I) = 7187mAve ff=uc4( $ I)u4( P) v1+u4( I) v2= 295veff取整为 2006 扩展不确定度 合成标准不确定度接近正态分布, 接置信概率 95%估计, 包含因子查 t 分布表 k95= 1196, u95= k95#uc( $ I )= 1196 7187= 1514mAU16mA7 不确定度报告 利用本计量标准检定压力变送器的测量误差的扩展不确定度为u95= 16mA,veff= 295差压变送器的输出误差的测量不确定度评定过程同上, 在此不再赘述。 需要说明的是随着科学技术的发展, 压力变送器正向智能化方向发展, 准确度等级越来越高, 功能也越来越强大。压力变送器检定装置也随着向智能化方向发展。 JJG882- 20045压力变送器6检定规程应及时作出修改。参考文献 1 国家质量监督检验检疫总局. JJG882- 20045压力变送器6 检定规程. 中国计量出版社.作者简介:金希永, 男, 助理工程师。工作单位: 桓台县计量检定测试所。通讯地址: 256400 山东省淄博市桓台县张北路3578 号。收稿日期: 2012- 04- 0990 5计量与测试技术62012 年第 39 卷第 8 期
