猪皮透明质酸的制备研究

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1、上海大学学报990 3l o g o . g i f ( 2 519 b y t e s )上海大学学报（自然科学版） JO U RNA L O F SH A NG H A I U NIVERSIT Y 1999年 第5卷 第3期 Vo l . 5 No . 3 1999q k l o g o . g i f ( 10 30 b y t e s )猪皮透明质酸的制备研究陆文雄 陈 鹏 严雅静提 要 透明质酸是葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的双糖交联形成的一种高分子均聚糖, 广泛应用于临 床医学和高级化妆品生产. 本文报告以新鲜猪皮为原料, 采用酶解法制备高纯度透明质酸的初步工艺, 为猪皮 透明

2、质酸的扩大生产提供实验依据. 关键词 透明质酸; 猪皮; 酶解; 制备 中图法分类号 O 6 41St u d y o n Pr e p a r a t i o n o f H y a l u r o n i c A c i d f r o m Pi g Sk i nLu W e n x i o n g Ch e n Pe n g Ya n Ya j i n g ( Sc h o o l o f Ch e m i s t r y a n d Ch e m i c a l En g i n e e r i n g , Sh a n g h a i U n i v e r s i t y )A b

3、 s t r a c t : H y a l u r o n i c a c i d i s a h i g h m o l e c u l a r w e i g h t h o m o p o l y s a c c h a r i d e c o m p o s e d o f r e p e a t i n g u n i t s o f g l u c u r o n i c a c i d a n d N-a c e t y l -g l u c o s a m i n e . T h i s p a p e r d e a l s w i t h p r e p a r a t

4、i o n o f p u r e , h i g h m o l e c u l e w e i g h t h y a l u r o n i c a c i d f r o m f r e s h p i g s k i n b y e n z y m e d i g e s t i o n p r o c e s s , w h i c h w a s i n t e n d e d t o p r o v i d e e x p e r i m e n t a l d a t a f o r f u r t h e r b a t c h p r o d u c t i o n .

5、K e y w o r d s : h y a l u r o n i c a c i d ; p i g s k i n ; e n z y m e d i g e s t i o n ; p r e p a r a t i o n透明质酸( H y a l u r o n i c A c i d , 以下称H A ) 是一种独特的线性大分子粘多糖, 由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡 萄糖的双糖单位反复交替连接而成, 它广泛分布于动物和人体结缔组织细胞外基质中, 在眼玻璃体、脐带、 皮肤、软骨和滑液中含量较高. H A 因其高度的粘弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性, 作为一种可 吸收、可降

6、解的生物材料, 已广泛应用于临床医学和高级化妆品生产, 近年来H A 市场需求与日俱增, 表现出 良好的市场潜力和广阔的应用前景1. 目前提取H A 的组织原料主要是脐带和鸡冠, 由于原料短缺, 生产受 到很大限制, 猪皮是一类H A 含量较高的动物皮肤, 相对鸡冠、脐带而言, 猪皮含有大量的胶原蛋白和脂肪, 不 易制成粉末, 其中的H A 难以提取, 至今尚无猪皮H A 工业化生产的报道.1 材料与方法1. 1 材料S16 6 中性蛋白酶( 上海新型酶制剂厂) , 乙醇( 工业级) , 溴代十六烷基吡啶( M e r c k ) , 透明质酸( Si g m a ) , 新鲜猪 皮. 1.

7、2 实验方法2 , 3 新鲜猪皮去尽脂肪, 8 5 处理3 m i n , 切成小块, 用高速组织捣碎机捣碎2 次, 每次5 s , 称取捣碎猪皮1 k g , 加 入50 0 m l 蒸滤水, 2 g S16 6 中性蛋白酶( 预先用蒸馏水浸泡2 4 h ) , 5 g Ca Cl2, 40 酶解8 h 后, 用9层纱布过滤除去未 被酶解的残渣, 再加入5 g 活性炭、10 g 硅藻土、10 g Na Cl , 40 搅拌2 h , 抽滤, 往滤液加入2 倍体积95%乙醇, 4 放置过夜, 离心收集沉淀得H A 粗品. 将H A 粗品溶于2 0 0 m l 蒸滤水, 加入等体积氯仿, 充分搅

8、拌混合3 h , 静止 分层, 收集水相, 用氯仿再处理一次, 往水相加入10 m l 10 %( w / v ) 溴代十六烷基吡啶溶液, 放置3h , 离心收集沉淀, 将沉淀加入10 0 m l 0 . 4 M Na Cl 溶液中搅拌解离1 h , 40 0 0 r / m i n 离心收集上清液, 往上清液加入3倍体积95乙 醇, 放置过夜, 离心收集沉淀, 丙酮脱水, 真空浓硫酸干燥得H A , 新鲜猪皮H A 的产率约为0 . 14%.1. 3 产品质量检测f i l e : / / / F| / q k / s h d x x b / s h d x 99/ s h d x 990

9、3/ 990 318 . h t m （第 14 页）2 0 0 9-12 -2 2 2 3: 13: 52上海大学学报990 31. 3. 1葡萄糖醛酸含量测定：参照Bi t t e r -M u i r 咔唑法4, 以葡萄糖醛酸内酯作为标准品. 1. 3. 2 蛋白质含量测定：参照Fo l i n -酚法5, 以牛血清白蛋白为标准品. 1. 3. 3 分子量测定：特性粘度法6 , 采用奥氏粘度计, 毛细管直径0 . 55 m m , 样品用0 . 1 M Na Cl 溶液配制, 温度 2 5 , M a r k -H o u w i n k 常数：k = 0 . 0 16 , a = 0

10、. 8 41. 1. 3. 4 红外吸收光谱分析：PERK IN红外分光光度计, 分辨率为2 . 4 c m-1, 样品用溴化钾压片法, 在40 0 0 40 0 c m-1范围内扫描.2 结果与讨论2 . 1 H A 的热稳定性0 2 0 4. g i f ( 2 191 b y t e s )图1 H A 的热稳定性( 8 5)0 2 0 5. g i f ( 1999 b y t e s )图2 H A 的碱稳定性( 37 )H A 的线性分子链容易发生断裂, 造成分子量下降, 本实验以H A 溶液的流出时间变化来衡量H A 的稳定 性, H A 分解, 分子量下降, 溶液粘度也下降,

11、表现为流出时间下降. 样品用0 . 1M 的Na Cl 溶液配制成浓度为0 . 5 m g / m l , 在8 5 保温一定时间, 2 5 测流出时间, 保温时间对流出时间的关系见图1, 在中性条件下, H A 具有一定的 热稳定性, 保温12 0 m i n 后, 流出时间减少2 . 2 %, H A 发生缓慢的热降解. 因此, 新鲜猪皮用8 5 处理3 m i n , 可认为 其中的H A 降解程度很小.2 . 2 H A 的碱稳定性用1 M 的Na O H 溶液配制0 . 5 m g / m l 的H A 溶液, 37 保温, 2 5 测流出时间, 保温时间对流出时间的影响见 图2 ,

12、 随着保温时间的增加, 流出时间减少( 保温12 0 m i n 后, 流出时间减少6 . 9%) , 可能是因为H A 分子的糖苷键发 生水解或受-O-基的攻击而断裂, 导致分子量下降. 现有文献报道2 , 7 用Na O H 溶液37 保温使猪皮液化提 取H A , 在液化过程中H A 将不可避免地发生降解, 同时要消耗大量的碱, 故从产品质量和经济上考虑, 碱提法 不适合工业大规模生产H A .2 . 3 红外吸收光谱分析产品H A 和标准品的红外吸收光谱如图3, 在342 0 c m-1处有强烈的O -H 伸缩振动的特征吸收峰, 表明存在 着多糖羟基结构. 16 30 c m-1及15

13、6 0 c m-1处有C= O 和C-N伸缩振动及N-H 弯曲振动的特征吸收峰, 表明存在乙f i l e : / / / F| / q k / s h d x x b / s h d x 99/ s h d x 990 3/ 990 318 . h t m （第 2 4 页）2 0 0 9-12 -2 2 2 3: 13: 52上海大学学报990 3酰氨基结构. 在1410 c m-1和137 0 c m-1处有O = C-O -伸缩振动O -H 弯曲振动偶合产生的两个吸收峰, 表明存在 着糖醛酸上解离羧基和多糖羟基结构, 以上吸收情况与已发表的H A 双糖重复单位结构基本一致3.0 2 0

14、 6 . g i f ( 6 2 6 9 b y t e s )图3 产品H A 和标准品红外吸收光谱2 . 4 产品质量检测产品的质量检测结果见表1. 产品符合低蛋白( 0 . 2 %) 、高分子量( 约106) 、葡萄糖醛酸大于36 . 4%的质量 要求.表1 H A 产品质量检测结果质量指标 蛋白质含量( %)葡萄糖醛酸( %) 分子量检测结果 0 . 1140 . 29. 51053 结论( 1) S16 6 中性蛋白酶本是制革用酶, 但对酶解半熟猪皮特别有效. 酶解法在中性条件下提取H A , 可避免 H A 的碱性分解. ( 2 ) 酶解法制备猪皮H A , 设备简单、成本低廉、操

15、作周期短, 特别适用于中小型企业生产H A . 生产猪皮 H A 的同时还可提取硫酸皮肤素等其他粘多糖, 回收油脂, 达到资源综合利用的目的; 提取所用的乙醇、氯 仿、丙酮可通过蒸馏回收, 废水中的有机质也能自然生物降解, 该工艺不会污染环境. ( 3) 我国猪皮资源丰富, 以猪皮为原料提取H A 的工艺尚未得到开发, 若能利用猪皮生产出具有较高临床 应用价值的H A 制剂, 在医疗上和经济上都具有重要意义.作者单位： 化学与化工学院参考文献1 Ev e r e d D , W h e l a n J ( e d s ) . T h e b i o l o g y o f h y a l u r o n a n . Ci b a f o u n d a t i o n s y m p o s i m 143. Jo h n W i l e y & So n s , 198 9. 6 15 2 池木根等. 军事医学科学院院刊, 1995, 19( 1) : 55 3 沈渤江, 张天民. 医药工业, 198 6 , 17 ( 7 ) : 2 91 4 Bi t t e r T , M u i r H M . A n a l y t i c a l Bi o c h e m i s t r y , 196 2 , 4: 330 5 O l i v e