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1、文章来源 毕业论文网 浅析仙鱼汤对小鼠 Lewis 肺癌的作用文章来源 毕业论文网 毕业论文摘要： 【目的】探讨具有健脾清肺、化痰祛瘀作用的中药复方仙鱼汤对小鼠 Lewis 肺 癌生长的抑制作用及其相关的分子机制。 【方法】将 50 只 Lewis 肺癌荷瘤小鼠分为仙鱼汤 高、中、低剂量组（剂量分别为 1.747、0.874、0.437gkg-1d-1） ，环磷酰胺（CTX）组 （剂量为 20mgkg-1d-1） ，荷瘤模型组；计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率；制备单细 胞悬液，采用流式细胞仪检测各组小鼠 Lewis 肺癌细胞周期、细胞凋亡率；采用免疫组化 法检测各组 Lewis 肺癌小鼠的
2、bcl2 基因的表达。 【结果】仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX 组瘤体质量均低于模型组，肿瘤细胞凋亡率均高于模型组（.或 .） ，仙鱼汤各组随着药物剂量的增大，抑瘤率和肿瘤细胞凋亡率逐渐增加。仙 鱼汤高、中、低剂量组及 CTX 组处于 S 期的细胞比例均低于模型组（.或 .） ，呈现明显的 G0/G1 期阻滞现象。仙鱼汤各剂量组 bcl2 染色强度指数显著 低于模型组（.） 。 【结论】仙鱼汤具有抑制小鼠 Lewis 肺癌生长的作用，其机理 可能与通过降低 bcl2 表达从而促进肿瘤细胞凋亡有关。 关键词： 仙鱼汤药理学 肺肿瘤中药疗法 细胞凋亡 基因表达调控 细胞培养肺癌是严重危害人类健康
3、的恶性肿瘤之 1，中医药在肺癌的治疗中发挥着越来越重 要的作用。仙鱼汤是治疗肺癌的经验方，具有健脾清肺、化痰祛瘀之功效，多年的临床应 用已证实其具有较好的临床疗效1-2 。本研究通过动物实验，进 1 步研究了仙鱼汤对小 鼠 Lewis 肺癌生长的抑制作用，并从诱导肿瘤细胞凋亡及调控凋亡相关基因的角度探讨其 作用机理。现报道如下。1 材料与方法1.1 动物 C57BL/6J 小鼠，雌雄各半，体质量 1822g，SPF 级，由广 州中医药大学实验动物中心提供（合格证号：） 。1.2 瘤株 小鼠 Lewis 肺癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供，广 州中医药大学第 1 附属医院中医肿瘤研究所长期移
4、植传代。1.3 药物与制备 仙鱼汤组成：仙鹤草 15g，鱼腥草 30g，猫爪草 30g ，山海螺 30g，党参 15g，3片 10g，山慈菇 10g，浙贝母 15g，守宫 5g，天冬 15g，黄芪 30g，炙甘草 5g。由广州中医药大学新药研究中心制备，按照传统煎煮法煎煮，低、中、 高剂量组药物浓度根据人与动物体表面积与计量换算法计算3 ，低剂量组 1.092g/mL， 中剂量组 2.184g/mL，高剂量组 4.368g/mL，分别相当于临床等效剂量的 1、2、4 倍。制备 后于 4冰箱中贮存备用。环磷酰胺（CTX）注射用粉针剂为山西普德药业有限公司产品 （批号：） ，200mg/支，临用前
5、用生理盐水溶解，稀释浓度为 2mg/mL，根据 CTX 的半数 致死量（LD50）为 472mg/kg，注射用量为 LD50 的 1/31/5，故小鼠给药剂量设为 20mgkg-1d-1。1.4 主要试剂与仪器 碘化丙啶（PI）染液为晶美生物工程有限公司产文章来源 毕业论文网 品；bcl2 兔多克隆抗体、即用型过氧化物酶免疫组织化学染色（SABC）试剂盒 （SA1022）均为博士德生物工程有限公司产品；RPMI1640 培养基为 Gibco 公司产品；2 甲苯、乙醇，均为市售分析纯；超净工作台（苏净集团安泰公司） ；冷冻桌面离心机 （Eppendorf 5810R Centrifuge） ；解
6、剖显微镜（北京电子光学设备厂） ；37电热恒温水浴 箱（上海恒丰仪器仪表有限公司） ；ALTRA 型流式细胞仪（美国 Beckman coulter 公司） ；CS型烤片机（孝感市电子仪器厂） ；亿鸣200 病理图像分析系统（中国亿鸣） 。1.5 Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型复制 于液氮罐中取出 Lewis 肺癌细胞株 1 支，置于 37电热恒温水浴箱内，轻轻摇动令其尽快融化。取出冻存管，用酒精消毒后开 启，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加体积分数 10小牛血清 RPMI1640 培养基， 常规离心，制成瘤细胞混悬液，台盼蓝计数约为 1107/mL 瘤细胞。消毒小鼠右前腋，取 0.2mL（
7、约 11062106 个瘤细胞）接种于皮下。传代 3 次。在 wu 菌条件下剥离 Lewis 肺癌荷瘤鼠皮下瘤块，选取生长良好的瘤组织，剪碎、称质量，用细胞匀浆器制成匀浆， 按体积比 1：3 加生理盐水制成瘤细胞混悬液，接种于 C57BL/6J 小鼠右前肢腋窝皮下，每 只 0.2mL（约 11062106 个瘤细胞） 。1.6 分组及给药 接种 24h 后随机分为 5 组：仙鱼汤高剂量组（剂量为 1.747g/kg） 、仙鱼汤中剂量组（剂量为 0.874g/kg） 、仙鱼汤低剂量组（剂量为 0.437g/kg） 、 CTX 阳性对照组（剂量为 20mg/kg） 、荷瘤模型组。中药各组均予以 0
8、.4mL 中药灌胃， CTX 组予以 0.2mL 腹腔注射，荷瘤模型组予以 0.4mL 生理盐水灌胃，均每日 1 次，给药 14d。1.7 观察指标及检测方法1.7.1 小鼠生活状态观察 实验过程中观察小鼠的饮食、毛发、活动、 精神状态等情况。1.7.2 抑瘤率 末次给药后 24h，Lewis 荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，用眼科 剪分离剥取肿瘤，电子天平称质量，计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率4：p 抑瘤 =（1m 实验组/m 模型组）100%。1.7.3 细胞周期分析及细胞凋亡检测 取小块瘤组织，加入生理盐水洗 净血迹后倒掉，再加入 1mL 生理盐水，用眼科剪剪碎组织，吸管轻轻吹打，过 300 目
9、筛， 收集单细胞悬液于流式专用管，加入 2mL 中性磷酸盐缓冲溶液（PBS） ，1 300r/min 离心 5min 洗涤 2 次，调整细胞计数约 1106/mL，加入体积分数 70冰乙醇 2mL 吹打后封口固 定，保存于 4冰箱 24h。将固定的单细胞悬液离心，去固定液，加入 PBS 重新悬浮，洗 涤 2 次，300 目筛网过滤 1 次，加入 1mL PI 染液（终浓度 100mg/L） ，4避光染色 30min，流式细胞仪检测，收集 50 000 个细胞，应用 multicycle 软件分析凋亡率5 。1.7.4 病理检查 肿瘤组织经体积分数 10福尔马林固定 24h 后常规石 蜡包埋，4
10、m 厚连续切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察肿瘤生长、肿瘤坏死、间 质反应和肿瘤及肿瘤周围组织炎症细胞浸润情况并摄片。1.7.5 bcl2 阳性表达检测 采用免疫组化法。常规石蜡包埋后，4m 厚 连续切片，行 SABC 法免疫组织化学染色，用 PBS 液代替 1 抗做阴性对照。光学显微镜下 观察，bcl2 蛋白染色细胞浆呈棕黄色为阳性。在高倍镜视野（400）下随机计数 5 个视野。 计算出各组的染色强度指数（staining intensity index ，pSII） 。pSII（pA 强度瘤细胞0） （pB 强度瘤细胞1）（pC 强度瘤细胞2）（pD 强度瘤细胞3） 。其中 A 强度
11、代表 细胞浆 wu 特异性染色；B 强度代表细胞浆呈特异性浅棕黄色，染色较浅；C 强度代表细 胞浆呈特异性棕黄色；D 强度代表细胞浆呈特异性深棕色，染色较深。染色强度指数 （pSII）的范围在 03 6 。1.8 统计学分析 采用 SPSS 11.5 统计软件处理。文章来源 毕业论文网 2 结果2.1 1 般状况的观察 实验结束后，模型组、CTX 组小鼠表现为身体瘦 小，活动少，喜聚群，毛发缺少光泽；CTX 组小鼠于实验 57d 开始出现脱毛，进食减少； 仙鱼汤高、中、低剂量组小鼠脱毛现象少于 CTX 组及模型组，活动力优于 CTX 组及模型 组。2.2 各组抑瘤率比较 表 1 结果表明，仙鱼
12、汤高、中、低剂量组及 CTX 组瘤体质量均低于模型组（.或.） 。各仙鱼汤组随着药物剂量的增大， 瘤体质量逐渐减轻，抑瘤率逐渐增高。表 1 各组 Lewis 肺癌小鼠的瘤体质量及抑瘤 率比较（略）Table 1 Comparison of tumor mass weight and tumorinhibitory rate in different groups统计方法：单因素方差分析；.，.，与模型组比较2.3 各组细胞凋亡率及细胞周期分析 仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX 组小鼠 Lewis 肺癌细胞凋亡率均高于模型组（.或.） ，各仙鱼汤组随 着剂量的增大，凋亡率亦逐渐增加。仙鱼汤高、中
13、、低剂量组及 CTX 组处于 G0/G1 期细 胞的比例均高于模型组，其中仙鱼汤高剂量组、CTX 组与模型组比较，差异有显著性意义 （.） 。仙鱼汤高、中、低剂量组及 CTX 组处于 S 期细胞的比例均显著性低于模 型组（.或.） ，呈现明显的 G0/G1 期阻滞现象。仙鱼汤高、中、低剂 量组及 CTX 组处于 G2/M 期细胞的比例与模型组比较，差异 wu 显著性意义 （.） 。结果见表 2、图 1。2.4 光镜观察 模型组癌细胞大小和形态很不 1 致，可见瘤巨细胞；癌 细胞核体积增大，细胞核和细胞浆比例增大，核的大小、形状、染色不 1，可见巨核、多 核，核染色深，核染色质呈粗颗粒状，分布不
14、均匀；核仁肥大，数目增多，核分裂相增多， 可见不对称性、多极性及顿挫性等病理性核分裂相，间质内淋巴细胞少见（图 2-a） 。CTX 组可见大片坏死，间质见较多的淋巴细胞等炎细胞浸润，纤维组织反应性增生（图 2-b） 。 仙鱼汤各剂量组可见癌巢内坏死面积增大，间质可见淋巴细胞等炎细胞浸润，可见较多的 细胞凋亡小体（图 2-c、d、e） 。2.5 各组 bcl2 染色强度指数 凋亡相关基因 bcl2 的阳性产物主要位 于细胞浆，可见大量的细胞浆棕黄色颗粒染色。仙鱼汤各剂量组 bcl2 的染色强度指数均 显著低于模型组（.） ，并呈剂量依赖性，而 CTX 组与模型组比较差异 wu 显著 性意义（.）
15、 。结果见表 3、图 3。表 2 各组小鼠 Lewis 肺癌组织的细胞凋亡率及细胞周期分析（略）Table 2 Comparison of cell apoptosis ratio and cell cycle analysis in different groups统计方法：单因素方差分析；.，.，与模型组比较a.模型组 b.CTX 组 c.仙鱼汤低剂量组 d.仙鱼汤中剂量组 e.仙鱼汤高剂量组图 1 各组凋亡率检测流式细胞图谱比较（略）Figure 1 Results of cell apoptosis ratio detected by flow cytometer in different groupsa.模型组 b.CTX 组 c.仙鱼汤低剂量组 d.仙鱼汤中剂量组 e.仙鱼汤高剂量组图 2 各组肿瘤组织形态比较（HE 染色，400） （略）Figure 2 Morphological changes of tumor cells under light microscope in different groups（HE staining，400）文章来源 毕业论文网 a.模型组 b.CTX 组 c.仙鱼汤低剂量组 d.
