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1、 249 第十七章 流式細胞技術 Flow Cytometry 謝世良 國立陽明大學 免疫學研究中心 主任 一、前言 流式細胞儀（flow cytometer）是現代生物學研究不可或缺的利器，除了可鑑定細胞的標 記外，還可分析細胞的分裂週期、DNA 含量、細胞凋零死亡（apoptosis） 、細胞內鈣離子的 濃度變化、pH 值之改變等等。此外，流式細胞儀更可將細胞篩選出來，供進一步研究， 因此瞭解流式細胞儀的原理及用途，可為將來研究發展提供一個強而有力的利器。 二、流式細胞儀的演進 流式細胞技術（flow cytometry）是指在流體狀態下觀測細胞的一種技術，而流式細胞儀（flow cyto
2、meter）則是指細胞於流體狀態下移動時，能夠觀測及記錄細胞特質的儀器。流式細胞儀的發展，就像其它的科技發展般，是在科技演進的歷史過程中逐漸發展出來的。現代流式細胞儀的產生主要是來自(a) 顯微鏡的技術發展，(b) 血球計數儀器（cell counting instrument）的技術演進及 (c) 於 1960 年代為了發展電腦用印表機的噴墨技術（ink-jet technology）等三方面為基石而發展出來的。 自 17 世紀以來，顯微鏡已被廣泛用來觀察細胞及組織切片。到了 19 世紀末，細胞染色技術也被陸續開發出來，使得細胞內部的各式各樣的結構在顯微鏡之下變得更清晰可見。1940 及 1
3、950 年代發明的螢光顯微鏡技術（fluorescence microscopy） ，使人類可利用螢光染劑（fluorescent dye）來偵測 DNA 以利癌症細胞的觀察。多株抗體（polyclonal antibody）的發展，使 Albert Coons 得將螢光染劑與抗體結合，更大幅提昇螢光染劑的用途。照相機及光偵測器 （photodetector） 的發展，使我們得以記錄顯微鏡下螢光圖像。由 Khler 及 Milstein（1984 年諾貝爾獎生理學得主）發展的單株抗體（monoclonal antibody）技術，使得人類可生產具有高度特異性（specificity）及同質性
4、(homogeneity) 的單株抗體，這些抗體可分別與不同的細胞成份結合（binding） ，對後來的流式細胞技術的發展有極大的貢獻。 1934 年，位於 Montreal 的 Andrew Moldavan 是將靜態顯微鏡（static microscopy）轉換成流式系統（flowing system）的先驅人員。他建議發展一種顯微儀器，使我們可觀察到通250 過毛細管的白血球及被中性紅（neutral red）染上顏色的酵母菌細胞，此儀器因加上了光偵測器 （photodetector） ，所以可記錄通過顯微鏡下的細胞形狀及數目。雖然我們不清楚 Andrew Moldavan 後來是否可
5、真正地製造出此機器，但此種觀念卻是今日流式細胞儀的雛型。 1960 年代中期，Louis Kamentsky 依 Moldavan 的觀念，發展出一種以顯微鏡為基礎的分光光度計（microscope-based spectrophotometer） ，使我們首次得以在每秒超過 500 顆細胞通過顯微鏡觀察點的速度下，仍能觀察到細胞吸收紫外線（ultraviolet absorption）及藍色的散色光（scatter of blue light）的能力。1967 年 Kamentsky 及 Melamed 更進一步加以改進，增加細胞篩選系統（sorting system） 。至 1969 年，
6、居住於德國 Mnster 的 Dittrich 及Ghde，描繪出一種流式細胞儀，使我們可偵測到由酒精固定的 DNA 與 ethidium bromide結合所產生的螢光。 在這一段流式細胞技術進展的時期 ， Nallace Coulter 發展了所謂的 ”Coulter Technology” 以分析血球細胞。在 1950 年代，Coulter 製造了一種儀器以計數在液相系統（liquid system）流動的細胞。其原理是當血球細胞經過孔洞 （orifice） 時，會排擠等張生理食鹽水溶液 （isotonic saline solution）而提高電阻（electrical resista
7、nce） ，大的細胞排出的等張生理食鹽水的體積大，因此產生的電阻也大於小的細胞經過孔洞時產生的電阻。依據電阻的改變次數及大小，即可記錄通過的細胞數目及細胞的相對大小尺寸。這個 Coulter 計數器在當時很快就變成醫院血液科不可或缺的機器，因為它可提供自動化的計數血液中紅血球及白血球的數目。這機器就是今日流式細胞儀的前身，因為它具備流式細胞儀的所有特性：(a)能使單一細胞一個接一個的快速通過孔洞，(b)能以電子訊號來偵測細胞，及(c)具有訊號分析的自動化。 為了進一步將細胞分離，Fulwyler 結合了 Coulter technology 及 RG Sweet 原先設計給電腦噴墨印表機使用的
8、噴墨技術（ink jet technology）而發展出第一台具有篩選（sorting）功能的流式細胞篩選儀，也就是今天被大家稱為 cell sorter 的前身。噴墨技術的基本原理即是利用高頻率振盪的噴嘴（vibration of nozzle） ，將水柱（stream）分裂成水滴（drop）並使打算篩選的水滴帶上電荷 ，再利用高壓電場使水滴產生偏折而被導入收集管中 。後來 Fulwyler再加以改進 ， 使含有細胞的水滴帶電 ， 再依照 Coulter 機器測量到的電子訊號 coulter volume 來決定給予含有特定細胞大小的水滴帶電，再利用電場使之偏折，如此即可分離出特定的細胞種類
9、。然而，當時的技術無法在液體流動時使細胞保持一個接一個的順序，時常會有 2 個或更多的細胞同時通過一個觀測點 ， 造成混亂的訊號 。 因此 Crosland-Taylor 利用 laminar flow的原理設計了一個水流系統（flow system） ，使細胞能在水柱的中央內一個接一個地流動，而不會有 2 個或更多的細胞同時通過一個觀測點的干擾現象，此即所謂的 hydrodynamic focusing 系統。 1969 年，位於 Los Alamos 的 Marvin Van Dilla 及同仁發展了第一部可偵測螢光的細胞儀（cytometer） 。此機器利用 argon laser 取代
10、傳統的顯微鏡燈源以激發螢光物質，並結合hydrodynamic focusing 及 Fulwylers sorter 的技術，發展了今日流式細胞儀 FACS （fluorescence activated cell sorter）的前身。不久之後，以 Stanford 大學 Herzenberg 教授251 為首的研究群也發展出類似的機器，除了具有上述機器的特點外，並結合了 multiple parameter fluorescence、light scatter、coulter volume 及 cell sorting 的功能，確立了今日大家使用的 FACS 的架構 。 當今兩大 FAC
11、S cytometer 的製造廠商 ， 總部位於美國東岸的 Coulter公司、西岸的 Becton Dickinson，即分別由 Coulter Technology 及與 Stanford 大學的研究人員技術合作所衍生出來的。 三、Flow Cytometry 的基本原理 由上述可知，flow cytometry 技術主要是為了快速偵測一顆接著一顆流動於液體水柱（fluid stream）中的顆粒或細胞，因此 flow cytometry 所偵測的訊號是以一個（而非一群）細胞或顆粒，被雷射光激發後產生的光學訊號，再轉換成電子訊號由電腦分析細胞或顆粒的特性，此種儀器我們稱為 FACS sca
12、nner。若加裝振盪的噴嘴（vibration nozzle）將水柱分裂成細小且含有單一細胞的微細水滴，加上正或負的電荷，並利用高壓電場使水滴產生偏折，則可篩選所要的細胞，此型機器稱為 cell sorter 或 FACS sorter。具有 sorting 功能的機器一定有 scan 的功能，但具 scan 功能的機器則不一定具有 sorting 之功能。 FACS 機器主要是由 3cs 系統所組成，即 fluidics，optics 及 electronics： 1. 流體學系統（fluidics） 流式細胞儀之流體系統主要的目的是將散布於 3 度空間水柱中的細胞或顆粒，使其能一顆接著一顆
13、地通過明亮的雷射光束。 (a) fluid flow 及 hydrodynamic focusing 之原理 圖一、flow chamber 的設計原理 Flow chamber 的設計可分為下列兩種方式，一為 laminar flow，一為 turbulent flow252 （見圖一） 。二者均可達成讓單一細胞有順序地通過偵測點，但 laminar flow 的解析度較佳，可使細胞與細胞之間的距離大於 turbulent flow，因而提高分析的正確性及篩選細胞的純度。 (b) fluidic 系統 常用的fluidic系統是使用正壓sheath fluid reservoir及sheat
14、h fluid進入flow chamber（見圖二）並同時加壓至含檢體之試管（sample tube） ，使 sheath fluid 與流體在 flow chamber（見圖三）混合，再進入分析腔（analytic chamber）或經由陶瓷噴嘴（vibration nozzle）將帶有細胞的 sheath fluid 水柱經高頻振盪成微粒水珠，再經過雷射光之截點（intersection point）而產生訊號（見圖三） 。 圖二、典型的流式細胞儀 fluidic 系統 圖三、典型的 flow chamber 設計 BA C 253 2. 光學及電子系統（optics and electr
15、onics） 當細胞或顆粒被雷射光激發後 ， 則會產生 0.5o 5o之前散射光 （forward scatter ， FSC）及 15o 150o之側散射光（side scatter 或 right-angle scatter 或 SSC） 。當顆粒本身帶有螢光物質（fluorochrome） ，或被帶有螢光物質的抗體或被其它螢光物質染上的話，則會產生波長不等的螢光（見圖四） 。由於入射光的波長小於螢光的波長，因此由光的波長及強度變化，即可測出顆粒的大小（與 FSC 成正比） ，顆粒性（與 SSC 成正比）與特定抗體或螢光物質結合情形。例如細胞可被帶 FITC（黃綠色螢光）的 anti-CD
16、3 抗體及帶 PE（紅色螢光） 的 anti-CD4 抗體結合，當細胞以波長 488 nm argon laser 激發後，則除了 FSC 及 SSC外，還會發出 520 nm（FITC）及 576 nm（PE）的螢光，這 4 種波長及強度，則可透過一連串的光學鏡片及偵測器，轉變成電子訊號，並以電腦加以記錄及分析，或可進一步依所要求的參數（parameter）將細胞分離篩選（sorting） （見圖五） 。 圖四、細胞經雷射光激發產生的散射光及螢光 圖五、典型的流式細胞儀設計圖 254 (a) 光源照明（illumination） 雷射（laser）的發明，使我們能將光線聚集至小於細胞的直徑，增加光線於單位面積的強度，因此照射到細胞顆粒時，可產生足夠的折射光及螢光，使偵測器捕捉到訊號。 (b) 光學收集器及偵測設施（collection optics 及 detection device） 被雷射光激發後所產生的光學訊號，經由一連串的透鏡（lens）及濾鏡（filter）後，可將光線依波長及散射角度引導到不同的偵測器，由於前散射光（FSC）較強，故以PIN d
