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1、Agilent 液相色谱柱与应用简单介绍 Bruce Lee 1.概述 Agilent 生产液相色谱柱以及气相色谱柱， 其液相色谱柱家族涵盖正相色谱柱， 凝胶色谱柱， 反相色谱柱以及手性分析色谱柱（ultron） 。反相色谱柱家族填料基质主要以 Zorbax Sil 以及 Zorbax Rx-Sil 为主，分离分析范围涵盖小分子至生物大分子聚合物。其中 Zorbax 家族色谱 柱主要包括 Zorbax Eclipse XDB 系列，Zorbax Eclipse Plus 系列，Zorbax 80 Stable Bond 系 列， Zorbax 80 Extend-C18， Zorbax Bon
2、us RP， Zorbax Poroshell 系列， Zorbax Polaris 系列， Zorbax Pursuit 系列。 Zorbax 色谱柱的填料基质硅胶采用自家生产的 B 型高纯度硅胶，其生产方式采用典型的堆 砌珠法（聚合诱导胶体聚集法） 。通过在硅溶胶分散体系中的聚合反应，将纳米级硅溶胶包 结成有机-无机复合微球，烧结除去有机物后得到全多孔硅胶微球（如下图 1 所示） 。 Fig. 1 堆砌珠法全多孔硅胶微球生产工艺 据 Agilent 公开资料显示，其生产的全多孔硅胶微球中 Na, Al, Fe 等金属杂质的总量100 ppm，使得该硅胶在低 pH 下的稳定性相比酸性 A 型
3、硅胶的稳定性得到显著的改善。 其推荐的方法开发流程如下图 2 所示。 Fig. 2 pH 从低到高方法开发指南 2.1.Zorbax Eclipse XDB 色谱柱 该系列色谱柱包括 C18，C8，Phenyl，CN 等四种，其色谱柱的典型物化特性列于下表 1。 Tab. 1 Zorbax Eclipse XDB 色谱柱典型物化特性 Zorbax Eclipse XDB 色谱柱粒径均为 80 ，比表面积均为 180 m2/g，最高允许操作温度均为 60，均采用三甲基硅氧烷二封端，烷烃侧链均为甲基（空间位阻效应较低） ，表面载碳量 与烷烃链碳数呈正比例变化（区别与 Waters BEH XBri
4、dge 色谱柱） ，除 XDB-CN 柱 pH 范围 为 2-8 之外， 其余三种均为 2-9。 从其表面载碳量看， 对于样品的负载量， XDB-C18 柱最大， 而 XDB-CN 柱则最小。 该系列色谱柱烷烃链与硅胶基质的键合方式如下图 3 所示，其工艺无法从公开资料获得。 Fig. 3 XDB 系列色谱柱烷烃链与硅胶基质的键合方式 从其键合方式可以看到， 该系列色谱柱的硅胶表面的裸露硅羟基的封端方式为三甲基硅氧烷， 此外与烷烃键合的 Si 的两个侧链为甲基，其空间位阻效应比较小，二次封端基本可以将大 部分硅胶表面裸露硅羟基封端。 此外，该系列色谱柱采用单键合方式（区别于三键键合方式） ，使
5、得有限的硅胶表面可以键 合相对更多的烷基链（但低于 Waters C18，C8，Phenyl 色谱柱） ；另一方面，单键键合方式 对于低 pH 条件的稳定性也要比三键键合方式要差。三甲基硅氧烷封端方式，长期于低 pH 条件下应用，封端 Si-O 键可能会发生水解，导致被分离分析物（特别是碱性化合物）的色 谱峰拖尾。XDB-C18 色谱柱稳定性如下图 4 所示（引自 Agilent） 。 Fig. 4 XDB-C18 色谱柱稳定性（pH=3, 60） 该图中 Competitive C 数据，个人觉得不具有可参比性，原因不多说。从其数据来看，结合 其填料特性， 封端方式以及烷烃链键合方式， 该系
6、列色谱柱如需长期应用与酸性流动相体系 下，其 pH 最好控制在 3-7 为宜（pH7，硅胶内部聚合发生断裂的可能与速率加快） ；而温 度建议不超过 40。 该系列的四种色谱柱，XDB-Phenyl 以及 XDB-CN（可应用正相模式）两种色谱柱可能会提 供与 XDB-C18 以及 XDB-C8 不同的选择性（下图 5） ，而这种选择性与“Agilent 本身”无 关，取决于苯基以及氰基与 C8，C18 的不同。而对于 Agilent 所声称的“超密度键合” ，则 需要有区别地， 有对比地看待； 而对其 “宽 pH 范围 （pH 2-9） 内提供良好的峰形”（下图 6） ， 除对色谱柱进行选择之
7、外，亦需要对流动相给予关注。 Fig. 5a Zorbax Eclipse XDB 色谱柱的选择性 Fig. 5b Zorbax Eclipse XDB 色谱柱的选择性 Fig. 6 拖尾因子比较 3. Zorbax Eclipse Plus 色谱柱 该系列色谱柱包括 Zorbax Eclipse Plus-C18，Zorbax Eclipse Plus-C8，Zorbax Eclipse Plus-Phenyl 三种色谱柱。该系列色谱柱与 Zorbax Eclipse XDB 色谱柱一样，均采用“超密度 键合”以及二封端技术，区别在于使用增强的高性能硅胶、新的封端试剂以及为高性能硅胶 而优化
8、的独特键合工艺。具体物化参数如下表 2 所示，分离分析范围覆盖碱性，酸性以及中 性化合物。 Tab. 2 Zorbax Eclipse Plus 色谱柱物化参数 从上表中数据与 XDB 系列相比，Plus-C18 以及 C8 具有更大的粒径，相对减少的比表面积 以及减少的载碳量。从公开资料中暂未找到“增强的高性能硅胶、新的封端试剂”的相关介 绍，有可能是金属离子含量更低的硅胶（100 ppm）以及空间位阻更大的封端试剂。 在中性流动相条件下，与其他厂家色谱柱对弱碱/酸性化合物的分离效果比较，如下图 7。 Fig. 7 Plus-C18 与其他厂家色谱柱对弱碱/酸性化合物的分离效果比较 4. Z
9、orbax 80 Stable Bond 色谱柱 Zorbax 80 Stable Bond 系列色谱柱包括 SB-C18， SB-C8， SB-C3， SB-CN， SB-Phenyl， SB-Aq 六种色谱柱。该系列色谱柱与 XDB 以及 Plus 色谱柱的区别在于低 pH 以及高温条件下的稳 定性。该系列色谱柱均采用单键键合，不封端的方式，其物化参数如下表 3 所示。 Tab. 3 Zorbax 80 Stable Bond 色谱柱物化参数 如上表所示，温度可达 80-90，pH 可低至 1。该系列色谱柱较适合使用在低 pH 环境下， 对于温度的稳定性最好；若需使用中等 pH 范围（6-
10、8） ，其温度最好不要超过 40，使用磷 酸氢铵意外的缓冲盐溶液，可增强色谱柱的寿命。化学键合方式如下图 8 所示。 Fig. 8 Zorbax 80 Stable Bond 色谱柱化学键合方式 其中 SB-C18R 基为二异丁基，其余如 SB-C8 等的 R 基为异丙基，两种基团均具有较大的空 间位阻，避免硅胶基质在低 pH 条件下被水解破坏，造成塌陷。 SB-C18 色谱柱在低 pH 和高温条件下的稳定性如下图 9 所示。 Fig. 9 Stable Bond SB-C18 在低 pH 和高温条件下显示出极佳的稳定性 此外 SB-Aq 色谱柱兼容 100%水相，而不会出现“孔内去湿”现象。
11、 5. Zorbax Bonus RP 色谱柱 Bonus-RP 色谱柱，特点在与长烷基链中嵌入的极性酰胺基团（与其他厂家 RP 柱类似） 。减 少了碱性化合物和硅胶基质之间的相互作用， 改善碱性化合物的峰形。 三封端进一步改善了 峰形，并延长了色谱柱寿命。 此外，二异丙基侧链（图 10）提供的空间位阻防止封端酸性水解，延长了在低 pH 条件下 的寿命。 Fig. 10 Bonus RP 色谱柱二异丙基侧链 Bonus RP 色谱柱的键合方式为单键键合（图 11） ，Bonus-RP 色谱柱提供了不同于 C18 和 C8 烷基键合固定相的选择性。 Fig. 11 Bonus RP 色谱柱键合方
12、式 其物化参数如下表 4 所示 Tab. 4 Zorbax Bonus RP 色谱柱物化参数 Bonus RP 色谱柱如其他 RP 色谱柱一样，完全兼容 100%水相。 5.Zorbax Extend-C18色谱柱Zorbax Extend-C18色谱柱采用双配位C18-C18单键键合技术 （图 12） ，提高色谱柱在高 pH 条件下的稳定性，C18-C18 键合方式也使得载碳量得到提升（表 5） 。 Fig. 11 Bonus RP 色谱柱键合方式 Tab. 5 Zorbax Extend-C18 色谱柱物化参数 该色谱柱可通过将 pH 调整至分析物的 pKa 以上 2 个单位，使得碱性分析物呈电中性，与烷 基链通过疏水相互作用而得到良好的峰形。 To be continued。 。 。 更多更新内容，请关注微信公众号药物分析与工艺分析或搜索Pharma_Analytical 或扫描下方二维码，交流请加微信号 Lindaring001。
