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1、氨基酸的离子交换柱色谱分离氨基酸的离子交换柱色谱分离【实验目的】1.掌握离子交换树脂分离氨基酸的基本原理； 2.掌握离子交换柱层析法的基本操作； 3.掌握氨基酸和茚三酮显色反应机理及洗脱曲线的绘制。【实验原理】1.离子交换层析原理离子交换层析是一种用离子交换树脂做支持剂的层析法.离子交换树脂是具 有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯和苯二乙烯等不溶性高分子化合物.树脂 一般都制成球形的颗粒.阳离子交换树脂含有的酸性基团如磺酸基(一 S03H),磷 酸基(一 P03H),亚磷酸基(一 PO2H),羧基(一 COOH),酚羟基(一 OH)等,可解离出 H 离子,当溶液中含有其他阳离子时,例如在酸性环
2、境中的氨基酸阳离子,它们可 以和 H 离子发生交换而“结合“在树脂上 本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732 型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸 Asp pI=2.97）和碱性氨基酸(赖氨酸 Lys pI=9.74)的混合液。在 pH5.3 条件下，由 于 pH 低于 Lys 的 pI 值，Lys 可解离成阳离子，吸附在树脂上；又由于 pH 高于 Asp 的 pI 值，则 Asp 可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱。在 pH12 条件下，因 pH 高于 Lys 的 pI 值，Lys 又解离为阴离子从树脂上被交换下 来，这样通过改变洗脱液的 pH 值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。2.茚
3、三酮反应机理在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色 缩合物。此反应为一切蛋白质和 氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨 酸产生黄色化合物)。含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。该反应颜色产物 在 570nm 处有最大吸收峰。【仪器与试剂】1. 仪器：层析柱（20cmX1cm）；铁架台；恒流泵；部分收集器；分光光度计；移液 枪；恒温水浴锅；试管玻璃棒烧杯等常用器材。2. 试剂：A732 型阳离子交换树脂 B2mol/L 氢氧化钠溶液 1mol/L 氢氧化钠溶液 0.01mol/L 氢氧化钠溶液 C2mol/L 盐酸溶液 D混合氢基酸溶液：天冬氨酸、赖氨酸均配制成
4、2 mgmL 的柠檬酸缓冲液 溶液。将上述天冬氨酸、赖氨酸溶液按 1：1.5 的比例混合 E柠檬酸缓冲液（pH5.3，钠离子浓度为 0.45mol/L） F茚三酮显色剂【实验步骤】1.树脂的处理（小老师完成）将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用 4 倍体积的 2mol/L 的盐酸浸泡 1 小时，倾去清液，洗至中性。再用 2mol/L 的氢氧化钠处 理，做法同上。（检验中性用试纸即可）2.树脂的转型与保存（小老师完成）以 1mol/L 氢氧化钠溶液浸泡处理后的树脂 1h，使树脂转化为 Na 型，用 蒸馏水洗至中性，多余树脂放入 1mol/L 氢氧化钠溶液保存，需使用的用欲使用 缓冲
5、溶液浸泡。3.装柱取（20cm X 1cm）层析柱，检验气密性。验得气密性良好后，将柱垂直 夹于铁架上。用夹子夹紧柱底出口处橡皮管，在柱顶放一漏斗并向柱内加入 2- 3cm 高的缓冲溶液。用小烧杯取少量树脂及浸泡液，将其搅拌成悬浮状，通过 漏斗缓慢倒入柱内。待树脂在底部沉降时，慢慢打开出口夹子，放出少许液体， 持续加入树脂，直至树脂高度达到 10cm。 注意：装好的柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整，否则倒回 烧杯，重新装柱。整个过程液面不可低于树脂床面。4.平衡层析柱装好后，缓慢加入适量缓冲液至液面高于树脂面 2-3cm。取一烧杯 盛有 25ml 缓冲液，装好柱子，柱上端胶皮管通过恒
6、流泵浸入烧杯液面以下， 柱下端置另一烧杯收集洗出液。后开启泵，调节流速，以 0.5ml/min（10 滴 /min）流速进行平衡，待 25ml 缓冲液基本用尽时即可加样。平衡过程大约 40- 50 分钟。5.加样关闭恒流泵，打开层析柱上端，缓慢打开柱底出口夹子，放出层析柱内液 体至层析柱内液体凹液面与树脂上表面约距 1mm，立即关闭出口。由上端缓慢 加入氨基酸混合液 0.5ml（用吸量管沿柱壁四周均匀加入）。加样后打开止水 夹，使液缓慢流出至凹液面与树脂上表面约距 1mm ，立即关闭止水夹。再加入 0.5ml 缓冲液（用吸量管沿柱壁四周均匀加入），打开止水夹，使液体缓慢 流出至凹液面与树脂上表
7、面再次约距 1mm ，重复此加入缓冲液操作 2-3 次， 最后加缓冲液至液面高于柱顶 2cm 左右。6.洗脱将层析柱装好并使下端对准部分收集器上的一号小试管口，用 PH5.3 柠檬 酸钠缓冲溶液以 0.5ml/min（10 滴每分钟）流速开始洗脱，小试管收集洗脱液， 每管收集 1ml，收集 10 管后，关闭恒流泵，同时夹住下端，改用 0.01mol/L 氢 氧化钠溶液洗脱，同法继续收集 11-35 管。收集完毕后，关闭止水夹和恒流泵。 (实验时柱内液体不可流干，柱子气密性不好时易出现流干情况)7.氨基酸色谱的测定向各管收集液中加入 2.5ml 柠檬酸钠缓冲溶液，混匀后加入 1ml 茚三酮显 色
8、剂，在沸水中加热 15min，取出冷却 10min。以收集液第 1 管为空白，测定 570nm 波长处各管的光吸收值。以光吸收值为纵坐标，以洗脱管号（洗脱体积） 为横坐标绘制氨基酸色谱图。（比色时请戴手套，避免将液体粘在手上或衣服 上，实验完毕后请将树脂倒入指定回收处，并清洗所有实验用具）8.树脂的回收与再生（小老师完成）树脂回收后，用 1mol/L 氢氧化钠洗涤浸泡，再用蒸馏水洗至中性后，可 再次使用。【数据处理】以光吸收值为纵坐标，洗脱管号（洗脱体积）为横坐标绘制氨基酸色谱图。【思考题】1.若实验结果的图谱中出现拖尾现象，试分析其原因。2.树脂的预处理中为何要将树脂转变为钠型？3.试简述平衡的作用及流速快慢对实验结果的影响。
