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1、本科学生实验报告本科学生实验报告学号： 124120463 姓 名： 学院： 生命科学学院 专业、班级： 12 级生物技术班 实验课程名称： 酶工程实验 教 师： 吴倩 云南师范大学教务处编印云南师范大学教务处编印实验序号及名称：实验四、淀粉酶粗酶液最适反应实验四、淀粉酶粗酶液最适反应 pHpH 的测定的测定 实验时间：2015.5.16实验地：睿智三 121 实验室一、一、实验目的：实验目的：了解不同 pH 对酶活性的影响，掌握酶最适反应 pH 的测定方法。二、二、实验原理：实验原理：当酶分子处于最适 pH 反应介质中时，酶、底物和辅酶的解离情况，最适宜于它们结合，并发生催化作用，使酶促反应
2、达到最大值。当反应介质的 pH 偏离酶的最适 pH，可影响酶分子，特别是活性中心上必须基团的解离程度和催化基团中质子供体或质子受体所需的离子化状态，也可影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶与底物的结合。当 pH 发生较大偏离时甚至会引起酶的变性。每一种酶都有其适宜 pH，在酶催化反应过程中，必须控制好 pH。三、三、实验材料（一）实验试剂1.淀粉酶发酵粗酶液2.不同 pH 的乙酸-乙酸钠缓冲液3.2%（w/v）可溶性淀粉溶液（现配现用） 称取 2.0 克可溶性淀粉，用约 80mL 缓冲液调匀，加热煮沸 直到淀粉完全溶解； 冷却，调不同的 pH 值，并用缓冲液定容至 100mL。5. DNS 试
3、剂（二）实验仪器1.试管及试管架 2.10mL 离心管3.离心机 4.移液器5.电子天平 6.恒温水浴锅7.pH 计 8.涡旋混合器9.紫外可见分光光度计、比色皿、记时器10.电磁炉、搪瓷缸四四 实验方法、步骤及注意事项：实验方法、步骤及注意事项：1.本实验选择不同 pH 测定淀粉酶粗酶液酶活力，以找出酶在此条件下的最适 pH 。反应温度为上次实验测出的最适反应温度。2.用不同 pH 的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释酶液至合适倍数。3.取 18 支试管，分别按下表编号并放入相应温度的水浴中试管 号对 照1支反 应2支对 照1支反 应2支对 照1支反 应2支对 照1支反 应2支对 照1支反 应2支对 照
4、1支反 应2支反应pH4.05.06.07.08.09.04.按淀粉酶酶活测定方法测定在不同温度条件下淀粉酶发酵粗酶液的酶活力。5.计算结果6.结果处理：列出不同 pH 下酶活力的实验测定数据，并绘出 pH 曲线，找出最适 pH 。注意事项1、每个同学都参与实验2、称量天平分开使用3、称量器皿用后摖净后再使用，避免叉污染试剂。4、 使用前检查仪器设备是否完好，使用后及时清理干净。五五 实验结果分析：实验结果分析： （一）实验结果 测得实验数据如下表PHA 管 O 值B 管 O 值平均值41.0110.9490.9851.5561.5301.54361.7491.6661.707571.6381
5、.5561.59780.6830.6650.67491.0011.0111.006计算酶活所用的标准曲线如下图：PH=4 时 和根据测量的数据和根据酶活计算公式： 酶活（U/ml）=（(AK+b)N1000/（TW） ）5A:样品的 OD 值(平均值) K:标准曲线的斜率N:稀释倍数 5:0.2 毫升反应液转换为 1 毫升体积 T:反应时间（min） 1000:转换因子 1mmol=1000molW:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）计算出酶活列表如下（稀释了 8 倍）： 酶活（U/ml）=（(AK+b)N1000/（TW） ）5=(0.980.9479+0.126)81000/(1018
6、0.2) 5=23.417 U/ml葡萄糖标准曲线y = 0.9479x + 0.126 R2 = 0.999800.20.40.60.811.21.400.20.40.60.811.2 OD葡萄糖含量（mg/ml）系列1 线性 (系列1)PH=5 时 酶活（U/ml）=（(AK+b)N1000/（TW） ）5=(1.5430.9479+0.126)81000/(10180.2) 5=35.263U/mlPH=6 时 酶活（U/ml）=（(AK+b)N1000/（TW） ）5=(1.70750.9479+0.126)81000/(10180.2) 5=38.725 U/ml PH=7 时 酶活
7、（U/ml）=（(AK+b)N1000/（TW） ）5=(1.5970.9479+0.126)81000/(10180.2) 5= 36.399U/ml PH=8 时 酶活（U/ml）=（(AK+b)N1000/（TW） ）5=(0.6740.9479+0.126)81000/(10180.2) 5= 16.979U/ml PH=9 时 酶活（U/ml）=（(AK+b)N1000/（TW） ）5=(1.0060.9479+0.126)81000/(10180.2) 5=23.964 U/ml 酶活结果为 PH酶活（U/ml） 423.417 535.263 638.725 736.399 81
8、6.979 923.964PH 曲线如下图pH对淀粉酶初酶液酶活的影响010203040500246810 pH酶活（u/ml）系列1六、实验总结六、实验总结由实验结果可以看出淀粉酶粗酶液在 pH=6.0 时酶活最高。七七 思考题思考题请自行设计该酶 pH 稳定性的测定方法。热稳定性酶即耐热酶，它是一类在高温下保温一段时间后，仍能保持一定活性的酶的总称。测量酶 pH 稳定性的方法：碘比色法。在一定的反应条件下，1 小时转化 1g 淀粉变为糊精的酶量定义为 1 个酶活力单位。取 16支试管分别加入 1%淀粉 5ml,每两支为一组分别在 pH 为 4，5，6，7，8，9，的梯度下在最适温度下预热十分钟，然后再分别加入稀碘液 1ml,在加酶液 1ml,记录反应时间，直至样品变无色为止。酶活计算公式： E=2%*5*1000*60/t/vt：降解淀粉时间V：酶液体积八八 教师评语及评分教师评语及评分：签名： 年 月 日六、实验总结思考题请自行设计该酶 pH 稳定性的测定方法。七教师评语及评分：签名： 年 月 日7、教师评语及评分：签名： 年 月 日
