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1、细胞支原体污染的荧光检测方法DNA 荧光染色法：荧光染色法： 1.原理：利用荧光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到 DNA 之 Adenosine-Thymidine (A-T) rich 区域，因为支原体之 DNA 中 A-T 含量占多数（5580%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之 DNA，证明有支原体之污染。 2.测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养 液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T
2、6 cell），然后培养指示细胞再作荧光染色。正负反应对照组亦可以接种于 indicator cell内作为对照。 3.待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作荧光染色。有些细胞易有荧光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。 4.特点：简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如 M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。 5.缺点：有时仍会有荧光背景，影响判读。 材料：材料： 1.Hanks balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS
3、, GibcoBRL 21250-014：、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或 chamber slide 替代物：35 or 60mm sterile plate 内放置无菌 22x22mm 盖玻片：浸于酒精内，使用前过火灭菌：，一般吸附型细胞均能吸
4、附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。 2.Indicator cells：Vero(African green monkey kidney,ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，细胞须先测试无污染。MEM with 10%FBS( medium for Vero cell) 配制试剂：配制试剂： 1.无菌 HBSS：配制 Hanks balanced salt solution，以 0.22mm 无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。 2.Hoechst
5、 33258 stock solution（100X）：称取 5.0 mg bisbenzimide 和 10.0 mg thimersol 溶于 100 ml 无菌 HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌 30 分钟至完全溶解后，以 1ml 分装至 1.5ml 小离心管中，贮存于-20。 3.Hoechst 33258 working reagent：取 1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入 sterile 100 ml HBSS 中，室温下搅拌 45 分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于 4。 4.mounting solution
6、：22.2 ml 0.1 M citric acid 和 27.8 ml 0.2 M Na2HPO4 加入于 50 ml glycerol中混合，以 1 N NaOH 调整 pH 至 5.5（pH 很重要），贮存于 4。 5.固定溶液（fixative）：冰醋酸与甲醇以 1：3 之体积比例混合，使用前才配制。 步骤：步骤： 1.培养 Vero 细胞： Vero 细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero 细胞。 2.在接种测试样品前一日，以 trypsin-EDTA 溶液处理 Vero 细胞，制成细胞悬浮液，以 12x104 cellsml 培养于 chamb
7、er slide 中，每个 well 加入 1ml 细胞悬浮液，于 37, 5CO2 培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。 3.接种测试样品：样品种类：1ml 待测之培养基，1ml 待测细胞培养 液（可将细胞稍微刮下：，0.050.1ml 冷冻管之细胞悬浮液。 4.将测试样品加入 chamber slide 内，培养 5 天后，进行 Hoechst 33258 的荧光染色观察。 5.以 Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染 Vero 细胞作为正反应对照组：或是已感染支原体之细胞培养 液或冷冻细胞液：，负反应对照组为 Vero cell 之新鲜培养基(
8、 MEM +10%FBS)。 6.DNA 荧光染色检测： 取出培养 5 日之 Vero 细胞，吸除培养液。于每个 well 中加入 2ml 1：3 混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置 10 min 后，吸除固定液。重复上述之步骤，风干 10 分钟。于每个 well 中，加入 1ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置 30min。吸掉 Hoechst 33258 染液后，以无菌水洗涤 3 次，风干后加入 1 滴的 mounting solution，并以盖玻片覆盖之。以 100x-400x 荧光显微镜观察。打开水银光源 10 min 后，以 UV 激发光束(3
9、30380 nm)之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色荧光小点或是丝状点之荧光物产生。 结果判读：若有支原体污染，在 Vero 细胞核外与细胞表面会出现蓝色荧光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其荧光可维持数星期。图例 (A)为 negative result ： 荧光显微镜下，只观察到 Vero 细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。(为 positive result ： 在 Vero 细胞核外与细胞表面会出现蓝色荧光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。 (A)Negative result 荧光显微镜下，只观察到 Vero 细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。
