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1、溴水氧化溴水氧化亚甲蓝荧光法测定头孢氨苄与头孢拉定亚甲蓝荧光法测定头孢氨苄与头孢拉定刘刘 奇奇1，杨红瑞杨红瑞，王爱军王爱军（河南师范大学 化学与环境科学学院，河南 新乡 453007）摘要摘要：基于头孢菌素与Br2发生氧化反应，剩余的Br2能氧化亚甲蓝（MB）使其荧光强度降低，通过测定亚甲蓝的荧光间接测定头孢菌素的含量，结合-环糊精（-CD）可以显著增敏亚甲蓝的荧光，建立了一种简单、快速、灵敏的测定头孢氨苄与头孢拉定的新方法。在优化的实验条件下，测定头孢氨苄与头孢拉定的线性范围分别为0.0012.8 mg/L、0.00082.2 mg/L，检出限分别为0.0002 mg/L、0.0006 m
2、g/L。本方法操作方便, 稳定性好, 灵敏度高,检出限低，可作为痕量头孢氨苄与头孢拉定的检出分析方法。关键词关键词：-环糊精；亚甲基蓝；头孢氨苄；头孢拉定；溴酸钾-溴化钾；荧光方法 头孢菌素类抗生素是一类临床使用极为广泛的广谱抗生素。头孢氨苄(cephalexin, CPX)和头孢拉定(cephradine, CPD)同属于第一代头孢菌素类抗生素,与同类药物相比对革兰氏阳性细菌具有更强的抗菌作用,且价格较低廉,故使用更为广泛。对此类头孢菌素的测定已见报道的方法有分光光度法 1-3 、荧光法4-7、流动注射化学发光法 8-9、高效液相色谱法10、电化学分析法11等。但分光光度法的灵敏度不够，高效
3、液相色谱法所需设备较昂贵,难于普及，而已报道的荧光法以及化学发光法均需对此类药物先在强酸介质或强碱介质中水浴加热水解20 min使其生成荧光产物，分析过程较长且步骤繁琐。本文基于Br2既能氧化头孢菌素，又能与亚甲基蓝（MB）发生氧化反应，使MB荧光强度降低，加入适量的-环糊精后，-环糊精与MB形成包合物，使MB荧光强度增至原来的2倍，建立了一种简单、快速、灵敏的测定头孢氨苄与头孢拉定的新方法。与文献4-7相比较，本法具有更高的灵敏度和更低的检测限，而且操作更简单，已直接应用于头孢氨苄与头孢拉定胶囊中CPX和CPD含量的测定，结果令人满意。 基金项目：国家自然科学基金 （20805011）项目资
4、助作者简介：刘奇(1964 - ) , 男, 河南信阳人, 副教授电子邮箱：E-mail: 电 话：159030452711 实验部分实验部分1.1 仪器与主要试剂仪器与主要试剂FP-6500 型荧光光谱仪日本 JASCO 公司；UV-1700 紫外可见分光光度计SHIMADZU；BS-110S 型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司） 。-环糊精（国药集团化学试剂有限公司，使用前经沸水重合晶两次，化学纯）：1.010-2 mol/L；亚甲基蓝（上海试剂三厂）：1.010-4 mol/L； 盐酸: 5 mol/L；KBrO3（上海试剂二厂）-KBr（北京化工厂）标准储备液12：250 mg/L（
5、准确称取0.0250 g KBrO3，0.2500 g KBr与100 mL容量瓶中，并用二次蒸馏水稀释至刻度） ，每次使用前稀释成25 mg/L的工作液；头孢氨苄标准品（CPX，中国药品生物制品检定所）储备液：100 mg/L（保存在棕色瓶中） ，每次使用前稀释成10 mg/L的工作液；头孢拉定标准品（CPD，中国药品生物制品检定所）储备液：100 mg/L（保存在棕色瓶中） ，每次使用前稀释成10 mg/L的工作液；其它试剂均为分析纯；实验用水为二次去离子水。1.2 实验方法实验方法在 10 mL 比色管中依次加入 10 mg/L 的头孢菌素溶液 3 mL，5 mol/L 盐酸0.4 mL
6、，25 mg/L KBrO3-KBr 溶液 0.6 mL 摇匀，反应 10 min；然后加入 1.010-4 mol/L 亚甲基蓝溶液 1.0 mL，反应 10 min 后再加入 3 mL 的 -CD，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置 30 min 后，以 660 nm 为激发波长，测定溶液的荧光强度 F，在同样的条件下扫描其紫外-可见光谱。2 结果与讨论结果与讨论2.1 荧光光谱及紫外荧光光谱及紫外-可见光谱可见光谱按 1.2.1 的实验步骤，分别绘制了在 5 mol/L 的 HCl 介质环境中，亚甲基蓝在 -CD 和水溶液中的荧光光谱图和紫外-可见吸收光谱图。由图 1 可看出，-CD 加入后
7、，MB 的荧光强度大大提高（曲线 1e 和 1f） ；头孢菌素加入后，由于头孢菌素与 Br2发生氧化反应，减少了 Br2对亚甲蓝的氧化，使得亚甲蓝的荧光进一步增强（曲线 1a 和 1c；曲线 1b 和 1d） ，这样可以在较低浓度下测定头孢菌素的含量；不管是荧光强度 F 还是吸光度 A 加入 -CD 后均大大提高；这些证明 -CD 可以作为增敏 MB 的敏化剂。6606807007207400100200300400a: CPD+ KBrO3-KBr+MB+-CDb: CPX+ KBrO3-KBr+MB+-CDc:CPD+ KBrO3-KBr+MBd:CPX+ KBrO3-KBr+MBe: K
8、BrO3-KBr+MB+-CDf: KBrO3-KBr+MBFnma bc d e f图 1 荧光发射光谱Fig. 1 Emission spectra图 2 紫外-可见吸收光谱图Fig. 2 Absorption spectraCHCl: 210-1 mol/L；CCPD: 3mg/L；CCPX: 3mg/L；C KBrO3-KBr: 1.5 mg/L；CMB: 110-5 mol/L； C-CD: 310-3 mol/L2.2 实验条件的优化实验条件的优化2.2.1 反应介质及酸度确定4505005506006507007500.00.20.40.60.8a: CPD+ KBrO3-KBr
9、+MB+-CD b: CPX+ KBrO3-KBr+MB+-CD c:CPD+ KBrO3-KBr+MB d:CPX+ KBrO3-KBr+MB e: KBrO3-KBr+MB+-CD f: KBrO3-KBr+MBAbs /nma b cde f分别以不同浓度的 HCl 为反应介质测定亚甲蓝的荧光强度 F，结果发现：在 5 mol/LHCl 溶液的介质中荧光强度最大，进一步研究表明 HCl 溶液加入量超过 0.4 mL 后，随着 HCl 浓度增大荧光强度减小，本实验选择 5 mol/L HCl 溶液加入量为 0.4 mL。2.2.2 KBrO3-KBr 溶液用量选择在 0.12.0 mL 体
10、积范围内，试验了 25 mg/L KBrO3-KBr 溶液的用量对亚甲蓝荧光强度的影响。结果表明，随着 KBrO3-KBr 溶液用量的增加，其 F 值先保持不变而后随着 KBrO3-KBr 溶液的用量的增加而下降，如图 3 所示，当KBrO3-KBr 溶液的用量在 0.4mL 时，体系中的头孢菌素已经反应完全，当KBrO3-KBr 溶液的用量超过 0.4mL 时，与头孢菌素反应后剩余的 KBrO3-KBr 在酸性介质中可以氧化亚甲蓝，使亚甲蓝的荧光强度降低，为提高其灵敏度选择KBrO3-KBr 溶液的用量为 0.6 mL。0.00.40.81.20100200300400500FV/mLa b
11、图 3 KBrO3-KBr 的量Fig. 3 Effect of KBrO3-KBra: CPD+ KBrO3-KBr+MB+-CD； b: CPX+ KBrO3-KBr+MB+-CDCHCl: 210-1 mol/L；CCPD: 3mg/L；CCPX: 3mg/L；C KBrO3-KBr: 1.5 mg/L；CMB: 110-5 mol/L； C-CD: 310-3 mol/L2.2.3 -环糊精的量的影响按照实验方法，只改变 -CD 的加入量，结果发现随着 -CD 浓度的增大，体系荧光强度依次增大，当 -CD 加入量大于 2.5 mL 时，F 几乎保持不变，故选择 -环糊精加入量为 3 m
12、L。2.2.4 温度的选择按照实验方法，分别测定了在 0，10，20，30和 40条件下不同温度对荧光强度 F 的影响。随着温度的增加，体系的荧光强度 F 逐渐减小；原因是随着 T 的增大，-CD/MB 包合物稳定性逐渐降低，MB 失去了 -CD 疏水性空腔对其激发态的屏蔽保护作用，导致 F 随 T 增大而减小。从线性范围和实验条件来综合考虑的话，本文选择室温作为实验温度。2.2.5 加入顺序和反应时间的影响实验表明，试剂加入顺序为头孢菌素溶液、HCl 溶液、KBrO3-KBr、MB、-CD 最佳。室温下，研究了 160 min 之间体系 F 随反应时间的变化情况。随着时间的增加体系 F 值逐
13、渐增大，25 min 后 F 达到最大且稳定，且至少可稳定 2 小时以上，故本实验选择在 30 min 后进行测定。2.3 干扰实验干扰实验考察了头孢拉定及头孢氨苄胶囊中共存组分的干扰情况,结果表明,对于质量浓度为3 mg/L的头孢拉定和头孢氨苄,500 倍的K+、Na +、Zn2 +、硬脂酸镁,100 倍的淀粉、Ca2 +、Mg2 +、PO43 - 均不产生干扰。2.4 工作曲线及检出限工作曲线及检出限按优化条件测定不同浓度的头孢菌素标准溶液。头孢氨苄与头孢拉定分别在 0.0012.8 mg/L、0.00082.2 mg/L 范围内与 F 呈良好的线性关系，标准曲线方程：头孢氨苄：F =99
14、.01c（mg/L）+ 14.91，相关系数 r = 0.9991；头孢拉定：F =132.17c（mg/L）+ 25.54，相关系数 r = 0.9998。对空白溶液进行 11 次测量，以其标准偏差 3 倍除以斜率得出头孢氨苄与头孢拉定方程的检出限分别为 0.0002 mg/L、0.0006 mg/L。对浓度为 10 mg/L 的头孢菌素标准溶进行十一次平行测定，头孢氨苄与头孢拉定的相对标准偏差为 1.3 %、1.1%。2.5 机理初探机理初探本文对相关反应物及反应产物在UV-1700 型紫外可见分光光度计下进行扫描, 其扫描结果如图4,因头孢氨苄在262 nm处有特征吸收,故可通过262
15、nm处峰值的变化来考察反应的进行情况;经比较从曲线4a到4b,可以认为曲线4b中大部分头孢氨苄已被Br2氧化;同时根据文献记载8,头孢氨苄的水溶液在262 nm处有最大吸收,是因为头孢氨苄分子中含有生色团O = C N C = C,所以可以认为图4的262 nm处的吸收峰与此生色团有关,随着反应的进行峰值的降低可知，该官能团已发生反应；由此得出该官能团参与了化学反应的结论。因为头孢拉定同样含有这个生色团O = C N C = C，所以也可以采用溴水氧化亚甲蓝的荧光法测定头孢拉定的含量。2002503003504000.000.040.080.120.160.20Abs nma ba: CPXb
16、: CPX+HCl +KBrO3-KBr图 4 紫外吸收光谱图Fig. 4 Absorption spectraCHCl: 210-1 mol/L；CCPX: 3mg/L；C KBrO3-KBr: 1.5 mg/L；2.6 分析应用分析应用采用本法对市售头孢氨苄胶囊（石药集团欧意有限公司） ，头孢拉定胶囊（石药集团欧意有限公司）中头孢氨苄与头孢拉定含量进行测定，结果如表 1所示。结果令人满意。表 1 实际样品中头孢菌素含量的测定结果Tab.1 Results for the determination of CPX and CPD in samples (n=5)样品测定值/ ( mg/L )标准加入量/ ( mg/L )回收量/ ( mg/L )回收率RSDCPX 胶囊0.98371.00001.979699.61.5CPD 胶囊0.
