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1、第 4 卷 第 1 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 4 No. 1 2013 年 2 月 Journal of Food Safety and Quality Feb. , 2013 *通讯作者: 赵丽, 副教授, 博士, 主要研究方向为微生物检验。E-mail: *Corresponding author: ZHAO Li, Associate Professor, School of Public Health, Shandong University, No.44, Wenhuaxi Road, Jinan 250012, China . E-mail: 酶联免
2、疫吸附法测定小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇 肖 娟1, 辛 苑1, 冯 莎1, 栾先国1, 李凤琴2, 赵 丽1* (1. 山东大学公共卫生学院, 济南 250012; 2. 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所, 北京 100052) 摘摘 要要: 目的 建立小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)含量测定的酶联免疫吸附(ELISA)分析方法。 方法 选取山东省 4 地区小麦样品 80 份, 用不同溶剂对小麦中的 DON 进行提取后,构建小麦中 DON 的ELISA 检测方法, 根据国家标准对检测结果进行评价。 结果 选用 84%的乙腈水溶液作为提取溶剂, 其平均回收率可
3、达 100.2%, 较为理想。该 ELISA 方法检测小麦中 DON, 线性范围是 55000 ng/g, 回归方程 Y= 0.0419X+0.0222, 相关系数 r=0.9868, 样品中 DON 含量为 5.273639.38 ng/g , 中位数为 79.25 ng/g, 在所检测的 80 份样品中, 有 4 份超出了国家规定的上限标准(1000 ng/g), 76 份符合国家规定, 合格率为 95。 结论 该方法灵敏、快捷, 适用于小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测。 关键词关键词: 脱氧雪腐镰刀菌烯醇; 小麦; 酶联免疫吸附法 Determination of deoxynivalen
4、ol in wheat by enzyme-linked immunosorbent assay XIAO Juan1, XIN Yuan1, FENG Sha1, LUAN Xian-Guo1, LI Feng-Qin2, ZHAO Li1* (1. School of Public Health, Shandong University, Jinan 250012, China; 2. Institute of Nutrition and Food Hygiene, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100
5、052, China) ABSTRACT: Objective To explore a method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determi-nation of deoxynivalenol(DON)in wheat. Methods A total of 80 wheat samples collected from 4 regions of Shandong province were extracted by different solvents, detected by ELISA and evaluated
6、according to na-tional standard. Results Optimal DON extraction was obtained when 84% acetonitrile was used in the extrac-tion agent which could guarantee the mean extraction rate of 100.2%. The method showed a good linearity over the range of 55000 ng/g for deoxynivalenol and the regression equatio
7、n was Y= 0.0419X+0.0222 with r=0.9868. The cotent of deoxynivalenol in wheat was 5.273639.38 ng/g with median of 79.25 ng/g. The con-centration of 4 samples among the totals was higher than the DON tolerance limitation of 1000 ng/g, and the qualified rate was 95%. Conclusion The method is accurate a
8、nd efficient and it is suitable for the determina-tion of DON in wheat. KEY WORDS: deoxynivalenol; wheat; enzyme-linked immunosorbent assay 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)是 B类单端孢霉烯族化合物中的一种,主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌的某些菌株产生, 在许多谷物如小麦、大麦和玉米中普遍存在。其化学性能稳定,具有较强w w w .c h a b z .c n第 1 期 肖 娟, 等: 酶联免疫吸附法测定小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇
9、225 的热抵抗力和耐酸性, 易溶于中等极性的有机溶剂, 在实验室中长期储存浓度不变1。DON 对粮谷类的污染状况与产毒菌株、温度、湿度、通风和日照等因素有关, 其污染不仅使农作物品质降低, 牲畜和人进食 DON 污染的粮谷后会发生急慢性中毒。一次性大量摄入 DON 可引起厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝或死亡等急性中毒症状, 而长期小剂量接触 DON 还可能造成免疫抑制、诱发多种正常细胞的凋亡, 甚至导致肿瘤的发生2。因此将粮食中DON 含量测定作为常规食品微量物质检测项目之一是非常必要的, 而选择一种简便、低廉的检测方法对于开展粮食中 DON 的常规检测至关重要, 本研究采用传统
10、的 ELISA 方法,优化检测步骤, 测定小麦中DON 含量。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 牛血清白蛋白, 购自盐城赛宝生物科技有限公司; DON 毒素购自北京泰乐祺科技有限公司; 抗DON 单克隆抗体(McAb)由本实验室制备3; 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG, 购自北京中衫试剂公司 ; DON- 牛 血 清 白 蛋 白 (bovine serum albumin, BSA)(Bbqure 公司); BALB/c 小鼠(动物批准号: SCXK-军 2007-004)购于中国军事医学科学院实验动物研究所。 1.2 样品的采集 按照地域划分, 在山东省聊城、临沂、烟台、潍坊 4 个
11、地区, 每个地区采集 20 份样品, 每份 500 g, 干燥密封保存。 1.3 抗 DON 单克隆抗体制备 采用文献4小剂量长周期的免疫方案, DON-牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)和偶联物免疫雌性 BALB/c 小鼠, 获得分泌抗 DON 的 McAb 的杂交瘤细胞株。 ELISA 检测上清液抗体阳性率。 采用小鼠体内腹水诱生法制备单克隆抗体, 饱和硫酸铵进行纯化。 1.4 竞争 ELISA 检测 DON 条件的建立 DON 标准工作液的配制: 用甲醇-PBS(73,v/v)将 DON 标准品溶解成为 1.00 mg/mL 的标准储备溶液, 20 保存。
12、 用 PBS 将 DON 标准储备液倍比稀释至 10.00、5.00、 2.50、 1.25 g/g、 625.00、 312.50、 156.25、 78.13、39.06、19.53、9.77、4.88 ng/g 12 个浓度。 用上述梯度稀释的 DON 标准工作液分别与 1:40的 McAb 溶液进行 11 混合, 置 4 竞争过夜, 同时用 PBS 作为空白对照。 以 DON-BSA 包被酶标板, 分别加入 McAb 与DON 毒素混合液及阴性对照, 每孔 100 L, 进行 37 孵育 2 h。用 PBS-T(PBS 中加入吐温)洗液洗涤酶标板 3 次, 每次 1 min。 将 HR
13、P-标记的羊抗小鼠 IgG 15000 用 0.5%的BSA 进行稀释后, 以每孔 100 L 加入酶标板中, 孵育 1 h。 加入底物缓冲溶液进行显色, 10 min 后终止反应, 于 405 nm 波长在分光光度计上测定吸光度值。以log2DON为横坐标, 相应的吸光度值(A 值)为纵坐标, 绘制竞争抑制标准曲线, 并计算出回归方程及相关系数 r 值。 1.5 DON 提取方法优化 1.5.1 小麦中 DON 提取溶剂的优化 将不含 DON 的小麦粉碎后, 取粉碎后的样品, 按照 1 g/g 的浓度添加 DON 标准溶液, 静置挥干溶剂后, 分别以含有 5%氯化钠和不含氯化钠的不同浓度甲醇
14、-水溶液(甲醇浓度分别为 55%、 65%)以及乙腈-水溶液(84%)提取样品中的 DON, 每个浓度做 3 个平行, 分别计算 DON 的回收率。 1.5.2 提取过程的优化 为模拟自然状态下 DON 在小麦中的分布以及排除提取液对检测结果的影响, 实验采用以下步骤: (a) 按照 1 g 小麦粉加 20 mL 提取溶剂的比例进行提取; (b) 选用 100 W 功率超声振荡 3 min 后过滤; (c) 取 4 mL 提取液于氮气气流下吹干; (d) 用 500 L 20%的甲醇溶液重新溶解; (e) 进行 ELISA 检测。 1.5.3 提取方法确证实验 为评价提取方法的重复性, 每个样
15、品设3个平行(加标量分别为 750, 1000, 1250 ng/g), 进行提取方法确证实验。以优化的方法提取并检测 DON, 每种样品每个加标浓度, 重复 3 次实验, 计算回收率、变异w w w .c h a b z .c n226 食品安全质量检测学报 第 4 卷 系数(CV%)。 1.5.4 小麦中 DON 检测 1.5.5 工作曲线的建立 样品中 DON 的检测采用标准加入法。 选取未检出DON 的小麦样品, 分别加入不同浓度的 DON 标准液, 使样品中 DON 的含量为 5000.00, 2500.00, 1250.00, 625.00, 312.50, 156.25, 78.
16、13, 39.06, 19.53, 9.77, 4.88 ng/g, 按上述优化的方法提取后, 用竞争 ELISA 检测提取液中 DON 的含量, 以log2DON为横坐标, 相应的吸光度(A)为纵坐标, 绘制工作曲线。 1.5.6 山东省 4 地区小麦样品检测 采用优化出的提取过程, 用所建立的 ELISA 方法对样品进行检测。依照食品安全国家标准食品中真菌毒素限量 (GB2761-2011)对样品中 DON 的污染情况进行评价。所有数据用 SPSS 软件包进行统计学处理。 2 结果与分析 2.1 竞争 ELISA 标准曲线的建立 竞争ELISA所得竞争抑制曲线见图1, 标准曲线的线性范围为55000 ng/mL,回归方程为Y=0.0419X+ 0.0222, 相关系数 r=0.9868。 图 1 ELISA 竞争抑制曲线 Fig.1 Com
