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1、中山大学 博士后学位论文 多糖衍生物用于蛋白质复性及多糖衍生物用于蛋白质复性及天然胶乳改性的研究 姓名：陈继平 申请学位级别：博士后 专业：高分子化学与物理指导教师：张黎明摘 要 环糊精和温敏聚合物聚异丙基丙烯酰胺） （）对蛋白质的复性均有良 好的促进作用，那么经改性后的环糊精衍生物能否更有效促进变性蛋白 质的复性呢？为此，我们将氨基环糊精（一）和带末端羧基的聚一 异丙基丙烯酰胺（）偶联得到了一种温敏一环糊精衍生物 （） ，分别考察其在不同变性体系、不同。浓度、不同复性 温度以及在表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（）存在下对溶菌酶的复性 效果；通过与和的对比分析，揭示了分 子中的环糊精空腔与链段
2、的协同作用，并使用荧光光谱法进行了验证。 实验结果表明：对盐酸胍变性溶菌酶的复性具有抑制作用，但对尿 素变性溶菌酶的复性具有促进作用；在常温下，的可使 溶菌酶的复性率增加至，而直接稀释法仅为； 对溶菌酶的复性温度应略小于的相转变温度（，。） ， 高于这一温度时会由于发生相变而导致溶菌酶的复性率急剧降低； 将在辅助溶菌酶复性一段时间（如）后再加入到复性体 系，溶菌酶的复性效果更佳。在辅助溶菌酶复性的过程中，分子中 的环糊精空腔与链段可以同时促进溶菌酶的复性，荧光光谱实验结果证实了这结论。 针对天然乳胶（）品蛋白质过敏及乳胶制品的生物降解问题，考察了海 藻酸钠、透明质酸及羧甲基纤维素的氧化产物氧化
3、海藻酸钠（） 、氧化透明 质酸（）和氧化羧甲基纤维素（）对天然胶乳中的蛋白质的固定作 用，对比了这三种氧化多糖对乳胶蛋白质的固定效果，分析了加入氧化多糖后蛋 白质在乳胶膜中的分布情况，讨论了氧化多糖含量以及氧化多糖分子中的醛基含 量对乳胶膜的力学性能、热降解及生物降解过程的影响。实验结果显示，三种氧 化多糖对天然乳胶中蛋白质都具有很好的固定作用；以为研究对象表明，乳 胶膜中含量越多，乳胶膜中水溶性蛋白质（）析出率越低，当占干 乳胶的 时，乳胶膜的溶出率即趋近于；中醛基含量越多， 溶出率越低，当醛基含量为 时，仅用 （以固含量计）的 可使乳胶膜中形孓晰出率低于眈。未加的乳胶膜在土埋天后的质量损失
4、率为叭左右，之后质量不再发生明显改变；而含有的乳胶膜在 土埋天后质量继续下降，其质量损失率超过乳胶中非橡胶成份所占的百分率， 且用量越大，乳胶膜的质量损失率越大。同时，氧化多糖对乳胶膜的力学性能无明显的影响。 关键词：一环糊精，聚（一异丙基丙烯酰胺） ，溶菌酶，复性，天然胶乳，多 糖衍生物，蛋白质固定，降解 第一章 温敏环糊精衍生物用于蛋白质复性的研究 引言由于环糊精分子中含有疏水性空腔，客体分子能从宽口端进入其分子空腔形 成包络化合物。因此在使用表面活性剂辅助蛋白质复性时，常常需要加入环糊精 以剥离与蛋白质形成胶束的表面活性剂或去污剂【。等人【发现，向 盐酸胍变性的碳酸脱水酶（）复性稀释液中
5、加入适量一环糊精（）可使其复 性率超过。他们认为这是由于环糊精的疏水性空腔与蛋白质复性中间体的疏 水性位点发生了相互作用。 聚烈异丙基丙烯酰胺） （）是一种具有温度敏感性的聚合物，在一定温 度下能发生亲水疏水（）逆转变，在水溶液中表现为一 种可逆的溶解沉淀行为【（在凝胶中则表现为一种可逆的溶胀收缩行为【】 ） 。发生这一转变时的温度即为相转变温度（ ， ） ，而水溶液的在附近，。曾被用于蛋白质的复性 研究【。如等人【将用于辅助的复性，发现其复性效率比更高，使用可使经盐酸胍变性的一的活性率提高，而 只能提高。等人【】曾采用，圆二色谱和荧光光谱等方法研 究了对尿素变性溶菌酶的复性机理，认为对溶菌酶
6、的复性作用是因 为增强了蛋白质的二级结构并抑制了溶菌酶的聚集作用，从而促进蛋白质的复性。 将与耦联，制备具有温度敏感的一环糊精衍生物（一） 主要被用于药物释放系统的研究协。虽然等人四曾将该体系用于溶菌酶的复性，但偶联产物中的结构单元主要用于剥离表面活性剂，而未考察其对溶菌酶的复性作用。结合等人】的研究，我们认为， 用于辅助蛋白质复性时，其分子中链段及环糊精的疏水性空腔应当可以同 时促进溶菌酶的复性，即具有协同辅助蛋白质复性的作用。 为验证这一假设，本研究采用端基耦联的方法，合成了具有温度敏感的 衍生物（） ，比较研究了及其合成中间产物：氨基一一环糊 精（） 、带末端羧基的聚（一异丙基丙烯酰胺）
7、 （）对尿 素变性溶菌酶的复性效果，并采用荧光光谱分析了对溶菌酶的复性 机理；同时探讨与十二烷基三甲基溴化铵（）结合使用时对溶 菌酶复性的协同作用。 实验部分原料与试剂异丙基丙烯酰胺（，公司，美国） ，正己烷重结晶；巯基丙酸 （，公司，美国） ； （一二甲氨基丙基）一乙基碳二亚胺（， 公司，美国） ；偶氮二异丁腈（，上海试四赫维化工有限公司） ，甲醇重结晶纯 化；一环糊精（上海伯奥生物科技有限公司） ，使用前于干燥 ；对甲苯磺 酰氯（中国医药集团上海化学试剂公司） ；溶菌酶、盐酸胍、二硫苏糖醇（订） 、还原型谷胱甘肽（） 、氧化型谷胱甘肽（）和微球菌均购自美国公 司。十六烷基三甲基溴化铵（）购
8、自日本公司；其余试剂均为分析纯。透析袋（ ，华美生物工程公司上海分公司）。样品溶液用去离子水配制。 的制备与表征 和 参，照等人的方法，在儿无水吡啶中依次加入 对甲苯磺酰氯，于、搅拌条件下反应。在减压蒸馏出吡啶后，向反 应混合物中加入水。过滤，水洗次除去吡啶，真空干燥得到白色粉末。将 上述制备的白色粉末与 无水乙二胺在反应 。在减压 蒸馏出无水二乙胺后，向油状物中加入 丙酮。过滤，将沉淀溶于 甲醇水溶液（体积比：） 。往所得溶液中加入 丙酮，得白色沉淀。过 滤，真空干燥。产品为白色粉末。用核磁和红外光谱进行表征。 的制备与表征 参照等人的方法，将 和 链转移剂溶解于 甲醇中。通氮气 ，加入 引
9、发剂，在氮气保护下，于 ”、搅拌条件下反应 。减压蒸馏出大部分甲醇，用丙酮正己烷体系纯化两 次。将所得沉淀过滤并真空干燥。产品为白色粉末。用核磁和红外光谱进行表征。 的制备与表征 参照等人的方法，将 溶解于 蒸馏水中， 加入 。调整溶液值为，加入 ，在室温下搅拌 反应 。所得溶液装入到透析袋（） ，用水透析 以除去未反应的 与小分子物质。溶液冷冻干燥得到一种淡黄色粉末。将所得的淡黄色粉末分散在 中，用（体积比：）沉淀，真空干燥。所得产品为黄色粉末。 用核磁和红外光谱进行表征。溶菌酶的变性 参照等人【】的方法，将一定量的溶菌酶分别溶于盐酸胍变性缓冲液和 尿素变性缓冲液（盐酸胍变性缓冲液： ? 、
10、 ?盐酸胍和 一硫酸，值；尿素变性缓冲液： 、 ?尿素、 ?”，值和? ）置于。下反应，使溶菌 酶彻底变性和还原，得到浓度为 ?。的变性溶菌酶溶液，放置于。冰箱 中保存备用。 溶菌酶复性将 浓度为 的一、或 溶液分别缓慢加入到 浓度为 的溶菌酶中，复性 后，加 入复性缓冲液至溶液总体积为 ，在室温下（ ）继续复性 。不含任 何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。复性缓冲液为为的、 晡溶液，该溶液还含有 和 。 浓度对溶菌酶复性的影响、 将 和 浓度为 溶液分别缓慢加入 到 浓度为 的盐酸胍变性溶菌酶和尿素变性溶菌酶溶液中。复性 后，加入复性缓冲液至溶液总体积为 ，在室温下（）继续复性 。不含任何辅助
11、剂时溶菌酶的复性为空白样。 复性温度对溶菌酶复性的影响 将浓度为 雕溶液缓慢加入到 浓度为 的尿素变性溶菌酶溶液中，然后将溶液在某一个特定温度条件下（、 ”、”、”、。或”）复性 后，加入复性缓冲液溶液总体积为 ，继续复性。表面活性剂对溶菌酶复性的影响将 浓度为 的溶液和 溶液按照以下方式加入到 浓度为 的尿素变性溶菌酶溶液中：） 仅加入溶液；）溶液和溶液同时加入；）在加入溶液 后再加入溶液。将这些溶液在室温（）下放 置 。以不含任何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。相转变温度（）的测定 通过测定浓度为 的和溶液在 的 吸光度值确定聚合物的相转变曲线。所用仪器为一 分光光度计（中 国，北京） 。吸光度一浓度曲线拐点的横坐标值即为该聚合物的平均值。 溶菌酶活性的测定 依据提出的以微球菌为底物的方法测定溶菌酶的活性。将微球菌溶于为的 一缓冲液中，使该溶液在 的吸光度为 。将 溶菌酶溶液加入到
