发酵法生产色氨酸

《发酵法生产色氨酸》由会员分享，可在线阅读，更多相关《发酵法生产色氨酸（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、发酵法生产色氨酸的研究发酵法生产色氨酸的研究刘辉 047111230摘要摘要：色氨酸是人和动物生命活动中 8 种必需氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈 代谢起着非常重要的作用。随着市场需求的不断增加，提高色氨酸生产能力成为全球热点。 本文综述了色氨酸应用及生产技术包括发酵生产色氨酸的菌种选育、发酵培养基原料和发 酵工艺等方面的研究进展。 关键词关键词：发酵法 色氨酸 1 1、 发酵法生产色氨酸过程中的菌种选育发酵法生产色氨酸过程中的菌种选育 生产菌种选育是发酵工业中最为关键的工作,受到普遍的重视。过去发酵法生产色氨酸采用 的是在培养基中添加吲哚或邻氨基苯甲酸的方法,此法因必须采用高价的吲哚

2、或邻氨基苯甲 酸做前体物质,使色氨酸的生产存在着成本高的缺点。而且由于这些前体物质对微生物的生 长有毒害作用,故不能大量使用1。目前,利用糖质原料直接发酵生产色氨酸的国内外报道不 多2-3,主要是因为色氨酸在微生物体内代途径较长且存在着多种严格的调节机制,致-色氨酸 的生产菌种产酸较低,达不到工业化生产的要求。色氨酸的生产菌种有谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutanicum)、黄色短杆菌(Bre-vibacteriumflavum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus sub-tilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产朊假丝酵母(Candida utili

3、s)等,其中绝大多数为细菌1。2 2、发酵法生产色氨酸过程中的发酵条件的选择、发酵法生产色氨酸过程中的发酵条件的选择 色氨酸发酵过程中菌种的质粒稳定性对发酵水平高低有严重影响，维持发酵高产酸就要 保证发酵过程菌种质粒稳定。 在培养过程可以通过调节适当罐压、培养温度、溶氧控制水 平、底料中酵母抽提物添加量等方面进行控制，保证发酵过程中不发生质粒丢失现象。 色氨酸发酵液中乙酸浓度高时对色氨酸生产菌的生长和产酸均有抑制作用，发酵过程中 可以通过调节溶氧控制水平、初始葡萄糖浓度、发酵葡萄糖浓度及控制菌体比生长速率等 方面进行控制，减少发酵液中乙酸的生成。 色氨酸发酵过程中产大量的热， 为了维持发酵温度

4、的稳定，必须采取适当的降温措施， 在发酵罐外部加上冷却盘管，采用冰水降温,控制发酵温度 33左右。 色氨酸发酵过程中由于无机盐的消耗及产酸引起 PH 变化，所以发酵过程中适当流加氨 水或液氨调节 PH，控制最佳 PH 值在 6.9 左右。 色氨酸发酵为耗氧发酵，并且产酸过程中用氧量比较大 ，溶氧的多少直接影响着代谢的 方向， 进而影响产酸和转化率， 溶氧低于 20%容易发生菌体自溶 、乙酸产量增加 ，所 以在主发酵过程中必须控制溶氧大于 20%，这要求我们采用先进的通风搅拌装置，设计合 理的发酵罐径高比，增加通气量提高溶解氧。 色氨酸发酵过程中，采用高糖流加技术 ，使发酵糖浓度始终处于低浓度，

5、从而有效减少 残糖对发酵产生的抑制作用，避免发酵后期产生乙酸上升的现象，保证高产酸及转化率。 此外，色氨酸发酵生产可采用先进的培养基连消技术， 高精度空气膜滤技术，使发酵污染 程度控制最低水平，确保发酵产酸水平；对发酵车间的环境定期进行消毒，提高环境清洁 度，对排污要控制，对排污口要用漂白粉处理，对空气过滤系统要定期清理，减少染菌机 率。43 3、发酵法生产色氨酸过程代谢控制、发酵法生产色氨酸过程代谢控制 芳香族氨基酸的生物合成存在着特定的代谢调节机制,因此不可能从自然界中找到大量积 累色氨酸的菌株，但是可以黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等为出发菌株,设法得到从遗传角度 解除了芳香族氨基酸生物合成正

6、常代谢调节机制的突变菌株,用微生物直接发酵法生产色氨酸“这些方法包括:解除菌体自身反馈调节、切断支路代谢、增加前体物的合成等。5 4 4、发酵法生产色氨酸产物提取工艺、发酵法生产色氨酸产物提取工艺 色氨酸的工业生产常常会受到生产成本的制约,而在生产成本的结构中,分离纯化等下游工 程的成本占有相当大的比例。据报道,从发酵液中分离纯化 L-色氨酸的方法有离子交换法6、 结晶法7等,其中离子交换法具有工艺简便、投资少、节能、污染少的优点,很适合于工业推 广。徐琪寿8等采用 D061 阳离子交换树脂从发酵液中分离纯化 L-色氨酸,提取率为 45%50%。梅丛笑等9采用 003*7 阳离子交换树脂从发酵

7、液中分离纯化 L-色氨酸,提取率为 68%。用 001*7 阳离子交换树脂吸附 L-色氨酸,浓缩结晶得到成品的总提取率为 73.10%10 5 5、不同菌种生产能力的比较、不同菌种生产能力的比较先后有 Osamu Kurahashi 等11-12、Katsumata Ryoichid 等18根据代谢控制发酵原理对 L-色 氨酸发酵进行了研究。王健等以谷氨酸棒杆菌 Tx5-32 为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)多次 诱变处理,定向培育出 1 株 L-色氨酸生产菌 TQ2223。在优化条件下,该菌株发酵 64 h 产 L- 色氨酸 7128 g/L13。Ikeda 以谷氨酸棒杆菌为出发菌株,经诱

8、变得到的 KY9456(Phe-+Tyr-)使 色氨酸积累达到 0115 g/L14。近年来基因工程技术的发展为色氨酸的菌种选育提供了一个 有效途径,也是今后育种的主要方向15-16。目前,基因工程技术主要是通过基因扩增,增大生 物合成途径中的限速酶(DS 酶基因、trpE、trpD、trpC、trpB、trpA)的表达量,进而提高色氨 酸产量。其次是通过对某些酶的基因进行体外诱变造成该基因所编码的酶不可逆失活,再将 突变基因导入色氨酸生产菌中,解除 Trp 的反馈调节或切断分支代谢从而有利于色氨酸的积 累15-16。如将与 Trp 合成有关的基因克隆到质粒 pDTS9901 上,然后导入 T

9、rp 生产菌 BPS-13 中,产色氨酸 3512 g/L(亲株产 2011 g/L)17。Aiba 等构建了包含 trp 操纵子基因(其中 trpE 和 trpD 基因失活)表达载体并克隆到 E1coli,使色氨酸产量达到了 612 g/L18。针对葡萄糖代谢 流途径的基因包括 pgi、serA、PRPP 合成酶基因等15。Yajima Yoshihiro 等人从色氨酸生 产菌(枯草杆菌)中分离出含 PRPP 合成酶的基因片段,将其克隆到质粒 pSEY146112 上，导 入具有 5-FTr 的枯草杆菌中,转化后 PRPP 合成酶的活力比原始菌提高 319 倍。该工程菌在 含邻氨基苯甲酸 0

10、1000 8 g/L 时发酵,产色氨酸量比原始菌株提高 11125 倍19。Ikeda 等人 将来源不同的色氨酸代谢途径中关键酶包括 DS 酶基因、色氨酸合成基因簇、ANS 酶和 PRT 酶基因同时进行谷氨酸棒杆菌 KY10894 菌株过表达,色氨酸产量提高了 54%,达到 43 g/L20。接下来将上述酶基因和酮糖转移酶基因转入色氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌 KY9218 中 进行过表达,色氨酸产量达 58 g/L,是目前报道的最高水平21。 6 6、色氨酸的市场需求量、色氨酸的市场需求量目前世界上一色氨酸年产量约 10000 多吨。据预测，一色氨酸未来的需求市场为 120 万吨。国内一色氨酸的生

11、产技术与国外相比还有较大的差距，目前只有少量生产，大规模的工业化生产还未见报道。1 范丙基.氨基酸工业大全M1 北京:轻工业出版社,1991:84-911 2 张素珍.产 L-色氨酸菌株的诱变选育J.微生物学报,1984, 24(3): 235-2421 3 刘晓婷,黄耀辉.黄色短杆菌 L-色氨酸产生菌的选育J1 工业微生物,1989, 19(6): 6-111 4 冯雨 发酵法 L- 色氨酸生产研究 科技向导,2011, 27(6): 6-111 5 王建 直接发酵法生产 L 一色氨酸的研究 天津科技大学博士学位论文 6 Shokei N, Naohiro M, Kiyoo M1Separa

12、tion method ofaminoacids: EP,428984 P11991. 7 Yoshinari S,Ryuta T,Masarn S.Crystallising aminoacid to givehighly pure crystals at low cost,using surfactant and/or alcohol:US,9009372 P119901 8 徐琪寿.发酵液中 L-色氨酸的提取J.氨基酸和生物资源,1978, 2(3): 11-141 9 梅丛笑,王福荣 1L-色氨酸提取工艺的研究D.天津:天津轻工业学院,2000110 郭长江,杨继军,韦京豫.发酵液中

13、L-色氨酸分离纯化工艺研究J.氨基酸和生物资源, 2007, 29(3): 42-461 11 OsamuKurahashi, KenzoYokozeki1Production ofL-tryptophan by5-fluorotryptophan and indolmycin resistant mutants ofBacillussubstilisK1J1J Agric Biol Chem, 1987, 51(1): 231-2351 12 Osamu Kurahashi , Mayumi Noda-Watanabe1Production of L-tryptophan by azaser

14、ine-, 6- Diazo-5-oxo-L-norleucine-and cinna-mate-resistant mutants ofBacillus substilisK1J1J Agric BiolChem,1987, 51(7): 1791-17971 13 张克旭,陈宁,张蓓,等 1 代谢控制发酵M1 北京:中国轻工业出版社,19981 14 王健,陈宁,张克旭.L-色氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究J.氨基酸和生物资源, 2003, 25(3): 41-431 15 Masato Ikeda1Towards bacterial strains overproducing L-t

15、rypto-phan and other aromatics by metabolic engineeringJ1Appl M-icrobiol Biotechnol12006, 69: 615-6261 16 陈涛,陈宁.L-色氨酸的生产及其代谢控制育种J1 生物技术通讯,2000, 11(2): 141-1451 17 IkedaM, Nakanishi K, KinoK1Fermentative production oftrypto-phan by a stable recombinant strain ofCorynebacterium glutam-icumwith a modif

16、ied serine-biosynthetic pathway J1BiosciBiotechnol Biochem,1994, 58: 674-6781 18 Aiba S, Tsunekawa H, Imanaka T1New approach to tryptophanproduction byEscherichia coli: genetic manipulation of compositeplasmids in vitroJ1Appl Environ Microbiol11982, 43: 289- 2971 19 Katsumata R, Kino K1Process for producing amino acids by fer-mentation:Japan,01,317,395 AP119891 20