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1、中药色谱指纹图谱相似度评价系统 与电子标准图谱应用 国家药典委员会 翟为民 1 中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2 背景 “关于加强中药注册管理有关事宜的通知关于加强中药注册管理有关事宜的通知”（国药管 注2000157号） “关于印发关于印发中药注射剂色谱指纹图谱研究的技术要中药注射剂色谱指纹图谱研究的技术要 求求的通知的通知”（国药管注2000348号） 国家药典委员会负责组织实施“已批准生产的中药注 射剂质量标准的提高完善及指纹图谱工作”及牵头组织“已 批准多家生产的中药注射剂，其指纹图谱联合起草工作”。 2000年12月起开始组织实施，进行了可行性调研、规 范性技术文件起草与研究、同步
2、进行科技部立项。 从中药注射剂的指纹图谱研究、质量标准提高，逐步 成熟、扩展，到2010版药典，部分提取物和中成药标准中收 载了指纹图谱项目。 3 1、论证 调研，多次研讨，代表涉及科研院所、中央和省级药品检验所 及企业科技人员。形成的共识： 理论上可行； 重点-色谱指纹图谱； 通过实践，检验可行性，不断完善。 2、修订中药注射剂指纹图谱研究技术要求（国药管 注2000348号） 优化、方法验证，细化参数、明确要求。 解决手工计算“共有峰”、“非共有峰”面积工作中大量 的人为因素，改变“只见树木不见森林”的局面，力求反 映整体质量特性。 4 规范性技术文件起草与研究 1、修订 广泛征求意见，审
3、议、修改，发布中药注射剂色谱指纹图 谱试验研究操作规程指南（试行），作为局颁“技术要求” 的补充。 细化规定：原料药材、半成品、成品的样品收集、制备、参 照物的选择，指纹图谱试验条件，对实验室的要求，对仪器 的要求，试验方法和试验条件的建立及验证，色谱条件的优 选，指纹图谱的建立和验证、识别、计算和复核，标准书写 格式等。 5 2、计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件的研究开 发 对于成药而言，如何控制批与批之间质量的稳定，这就要求需采 用某种手段能定量地表征各样品间的相似程度(或差异性)而不是 真伪鉴别，从整体性考虑，采用指纹图谱，在批间稳定等方面能 够发挥积极作用。 也就需要建立一套能整体
4、反应各样品指纹图谱之间相似程度的计 算方法，但原版“技术要求”采用共有峰和非共峰之比值的人工 计算方法，该方法仅考虑了人为选定的几个特征峰的相似性，即 将一个完整的事物割裂开进行比对，是不全面的，未能将中药内 在成分的整体特性表达出来，因此，要创建一套能定量比对整体 上反映中药内含成分指纹图谱相似程度的工具。 6 7 软件编制 国家药典委员会组织沈阳药科大学、浙江 大学、中南大学、清华大学、北京大学医 学部医药科技开发中心、西北大学、中国 药品生物制品检定所、第二军医大学八家 单位，于2004年集中测试修改定型计算 机辅助中药指纹图谱相似度计算软件。 软件的开发过程与中药注射剂指纹图谱的 科研
5、工作一直保持了同步。这种同步的应 用也给软件的测试使用创造了条件。 8 开发初期设计思路是将色谱数据导入MATLAB 的专业数据处理的软件中进行相似度的计算。 后考虑到知识产权保护的问题，采用自主编 程，将指纹图谱数据导入，数据库管理，计 算方法选择，谱图处理等功能，设计开发而 成。 软件基本思路与版本 一、对照图谱建立、相似度算法简介 二、修订改版工作 三、2.0版的介绍 9 1、对照指纹图谱的建立 （1）建立用于比对的对照指纹图谱 A、一种是选择代表性的一定批量（按照技术要求 如10批以上）样品，对上述样品通过实验获取样本图 谱，进行共有峰的提取，然后进行对共有峰进行均值 或中位数计算，并
6、以其计算结果，建立该样品的对照 指纹图谱； B、另一种是从实验样本中选择具有代表性的样品指 纹图谱，比如采用“道地药材”所对应的指纹图谱。 通常采用前者建立的对照指纹图谱进行方法学研 究，所建立的方法也用于后者。所以采取第一种。 10 ( (2 2) )关于关于两种两种对照对照模式的模式的计算计算 平均平均矢量矢量（重心重心）= = j j(x(x1 1j j,x,x2 2j j, , , , x xnjnj)/m)/m 中位数矢量中位数矢量=median(x=median(x1 1j j,x,x2 2j j, , , , x xnjnj) 11 两种对照两种对照模式模式 批样品中不存在离群(
7、outlier)样本时，一般推 荐使用平均矢量（重心）作为对照模式矢量 样品中存在离群样本时，推荐使用具有稳健 (robust)性质的中位数矢量来作为共有模式矢量， 这种情况可能在计算原料药材样本时的共有模式 出现。 采用具有稳健性质的中位数矢量来作为对照模式， 就不会因为原料药材样本中出现了一个离群样本 时而影响整个药材的对照模式。 如果不存在离群样本时，两种方法所得结果应该 基本一致。 12 2、对于样品相似度评价的算法 课题组同步进行了指南的制定与算法 的评价与选择，通过大量计量化学方面的 研讨与对比验证，选择了夹角余弦法。 13 14 中药指纹图谱是表征中药复杂成分与其质量关系的重要手
8、段中药指纹图谱是表征中药复杂成分与其质量关系的重要手段。在表征过在表征过 程中程中，相似度评价起着关键作用相似度评价起着关键作用。目前常用的相似度评价方法主要有峰重叠率目前常用的相似度评价方法主要有峰重叠率 法法（NeiNei系数法系数法）, ,相关系数法相关系数法, , 距离系数法距离系数法, ,向量夹角余弦法与峰重叠率和共向量夹角余弦法与峰重叠率和共 有峰强度结合法有峰强度结合法（改进的改进的NeiNei系数法系数法）。 评价评价方法方法比较与算法选择简介比较与算法选择简介 15 指纹图谱波动对各种评价方法的影响指纹图谱波动对各种评价方法的影响: 0.000.050.100.150.200
9、.450.500.550.600.650.700.750.800.850.900.951.00Similarity ABCDEFluctuating IntensityA.夹角余弦法夹角余弦法 B.相关系数法相关系数法 C.距离系数法距离系数法 D. Nei系数法系数法 E.改进的改进的Nei系数法系数法 由于药材的产地、来源、储藏条件和加工工艺的不同，以及仪器设备的稳定性等原 因使得指纹图谱产生一定的波动。举例：向痛必定粉针制剂高效液相色谱指纹图谱 中随机地加入一定强度的波动，以考查波动对相似度评价方法的影响。结果如上图。 结果表明：A方法受指纹图谱波动的影响最小 16 小峰的缺失的影响：小
10、峰的缺失的影响： A.夹角余弦法夹角余弦法 B.相关系数法相关系数法 C.距离系数法距离系数法 D. Nei系数法系数法 E.改进的改进的Nei系数法系数法 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 05% 03% A B C D E Similarity The scope of lost peaks in fingerprint 0 01% 在药材加工和提取过程中，药材中的某些成分往往会有一定的损失，导致 指纹图谱出现峰的缺失。假设峰的缺失主要为峰面积较小的峰，以5作为 阈值，将缺失峰分成01，03和05三组进行考察。 结果表明：A方法受小峰缺失的影响最小 17 在药
11、材加工和提取过程中，指纹图谱中大峰的缺失并不常见。而对于同属不 同种的药材，大峰的差异是有可能的。考察了大峰缺失的影响举例。 01230.40.50.60.70.80.91.0SimilarityNumber of larger peaks lost in fingerprintABCDEA.夹角余弦法夹角余弦法 B.相关系数法相关系数法 C.距离系数法距离系数法 D. Nei系数法系数法 E.改进的改进的Nei系数法系数法 大峰的缺失的影响大峰的缺失的影响： 结果表明：A方法受大峰缺失的反映较“灵敏” 18 数据标准化处理的影响数据标准化处理的影响 ： 距离系数 相关系数 夹角余弦 Spea
12、rman 系数 (= 0.01, 2-tailed, rs=0.735) 0.827 1 0.927 0.842 0.795 0.790 Influence of data autoscaling on different methods for evaluating similarity 数据标准化对表中三种评价方法所得结果影响较小 数据标准化处理一般会影响各种方法的相似度评价结果数据标准化处理一般会影响各种方法的相似度评价结果。 若处理前后样本的相似度评价结果的大小（等级）顺序 变化较小，说明标准化处理对样本的亲疏远近关系影响 较小，反之影响较大。采用Spearman相关系数进行检验。 1
13、9 20042004年版软件与算法简介年版软件与算法简介 版本: 研究版（2004 A） 检验版（2004 B） 研究版（2004 A） 检验版（2004 B） 应用范围 科学研究 指纹图谱的检验工作 功能 具有生成对照图谱功能 不具有生成对照图谱功能 结论 研究版（2004 A）的功能较多，且函盖了检验版（2004 B） 具有的功能 2004版以后，根据使用情况，验证并确认 保持核心算法不变。 根据使用中收集的反馈意见，补充必要的 需求，按照软件编制规范，彻底梳理并重 新编写了全部代码，在人机交互方面进一 步完善，并且为了适应管理需要增加了相 应的功能。进行了不同范围的测试，形成 了2.0版
14、（目前升级到2.1）。业已获得软 件著作权证书。 20 2.0版介绍 运行环境 1、硬件： 最低配置：CPU主频533 MHz以上，内存64M， 硬盘剩余最小空间100M，屏幕分辨率 800600。 2、软件环境： 支持的操作系统：windows 98，windows 2000、windows 2003、windows XP。 windows7（32位）（64位） 21 下载： 安装： 22 23 操作操作流程流程 生成对照图谱 24 检验 25 主界面 26 文件列表区：显示打开的图谱文件列表。 文件详细信息区：显示选中文件信息。 绘图区：绘制图谱，标注色谱峰。 状态栏：显示工作状态、当前
15、用户、登录 时间等信息。 27 快捷工具栏：常用按钮： 鼠标有提示 28 工作状态工作状态切换切换 注意提示：注意提示： 29 全谱导入（单、 多个）： *.cdf *.txt *.SCP *.XSCP 30 可打开三种格 式的报表： *.rdf *.qrp *.XQRP 31 导出导出文件文件 （图谱）（图谱） *.txt *.Scp 32 导出导出图像图像 *.bmp*.bmp *.*.wmfwmf 33 参照图谱参照图谱信息信息 34 删除选定的图谱删除选定的图谱 （可多选（可多选） 删除单个或多个图 谱。 也可以选定列表中 的文件，直接按 DEL键。 删除删除所有所有图谱图谱 多一项确认，再 清除。 35 视图菜单视图菜单 图谱图谱间距间距 调整图谱间距 36 放大图谱、缩小图谱、原始放大图谱、缩小图谱、原始大小大小 快捷工具栏或者菜单中选择、鼠标 37 单谱单谱显示显示 多谱显示多谱显示 38 显示显示或隐藏或隐藏色谱峰色谱峰 菜单、右键，显示或隐藏。 3.3.6 隐藏坐标轴 从菜单、右键，隐藏或显示。 39 随鼠标随鼠标 显示峰显示峰 信息信息 菜单、右 键，当鼠 标放在色 谱峰上时， 显示信息。 40 操作菜单操作菜单 3.4.1 设置当 前图
