《顺铂联合exosomes瘤苗抗肿瘤作用的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《顺铂联合exosomes瘤苗抗肿瘤作用的实验研究（56页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、重庆医科大学硕士研究生学位论文顺铂联合e x o s o m e s 瘤苗抗肿瘤作用的实验研究摘要目的：顺铂是目前国内外应用最为广泛的抗癌药物之一，大剂量顺铂化疗对癌细胞杀伤快而强，但对机体造成的副作用大。肿瘤疫苗作为机体内在的一种新的治疗手段，主要依赖于激活机体自身的力量去杀伤瘤细胞，这种杀伤力是有限的，并且缓慢。肿瘤疫苗联合化疗，可降低化疗药的剂量，减轻毒副作用。本实验用小剂量顺铂与小鼠肝癌H ：细胞分泌的e x o s o m e s 瘤苗联合应用，评价联合应用的抗肿瘤效果，研究其可能机制。从而为临床开展化疗后的肿瘤疫苗主动免疫提供了实验依据。方法：1 以小鼠肝癌H 。细胞为实验对象，研
2、究顺铂在体外对H ：细胞生长的抑制作用和顺铂对H 。细胞F a s 表达的影响：M T ，I 、法检测顺铂对H 。细胞的增殖抑制率；R T P C R 和W e s t e r nb l o t 分别检测顺铂对H 毖细胞F a s 的m R N A 和蛋白表达水平的影响。2 采用超速分级离心和蔗糖密度梯度离心提取纯化e x o s o m e s 瘤苗，以e x o s o m e s 瘤苗免疫小鼠，R T P C R 检i 贝1 e x o s o m e s 瘤苗对小鼠脾淋巴细胞F a s L 表达的影响。3 体外观察e x o s o m e s 诱导产生的特异性细胞毒性T 淋巴细胞(
3、C T L )活性及顺铂对C T L 杀伤的增敏作用，应用H o e c h e s t3 3 2 5 8 染色、电镜观气里鐾墨型奎兰堡主丝墨竺兰竺堡苎察H ，：细胞凋亡形态改变。4 建立B A L B C 小鼠肝癌移植瘤模型，从以下几个方面观察顺铂与e x o s o m e s 联合应用在体内对小鼠肿瘤生长的抑制作用：观察移植瘤小鼠生存时间；剥瘤后称重计算肿瘤抑制率；肿瘤组织行H E 染色观察，超微结构行透射电镜观察。5 在B A L B C d , 鼠肝癌移植瘤模型上观察顺铂与e x o s o m e s 瘤苗对荷瘤小鼠免疫功能的影响：称量各组小鼠胸腺和脾脏的重量，计算胸腺指数和脾脏指
4、数，t 用M T T 法检测B A L B c 小鼠脾细胞增殖情况和细胞毒活性；E L I S A 法检测顺铂与e x o s o m e s 瘤苗治疗后小鼠血清中m - 2 ，I N F 吖水平。结果：1 M T T 抑制率实验显示，顺铂在实验药物浓度下对小鼠肝癌H ：细胞的生长均有抑制作用，其抑制作用随浓度的增加而增大，呈剂量一效应依赖性。选择抑制率低的浓度：2 5 t g m L 和5 肛g m L 顺铂作为后续实验浓度。R T P C R 和W e s t e r nb l o t 检测结果显示经2 5 1 上g m L 和5 p , g m L顺铂作用2 4h 后，H 。细胞F a
5、sm R N A 水平分别升高3 1 倍和4 9 倍，F a s蛋白水平分别升高3 3 倍和5 1 倍。2 R T - P C R 结果显示，e x o s o m e s 免疫后的小鼠脾淋巴细胞中，能扩增出4 5 6b pF a s L 的特异性目的条带，未免疫的对照组脾淋巴细胞未见扩增出F a s L 的目的基因条带。3 低浓度顺铂( 2 5g g m L ) 预处理2 4h 后的H 船细胞对C T L 反应敏感性增强，在效靶比为1 0 ：1 、2 0 ：l 、4 0 ：1 、8 0 ：1 时的杀伤率4重壅垦型奎兰堡主堡塑竺兰篁望茎分别高于单独C T L 组，顺铂增强了C T L 的杀伤效
6、应。H o e c h e s t3 3 2 5 8染色和电镜结果显示H 2 。细胞出现凋亡的形态学改变。4 顺铂联合e x o s o m e s 瘤苗对移植瘤抑制作用最强，移植瘤质量为( 1 0 3 _ + O 1 4 ) g ，抑瘤率为6 4 4 。H E 染色可见联合治疗组肿瘤组织有大量淋巴细胞浸润；肿瘤组织超微结构透射电镜观察，联合治疗组除见到大量坏死细胞外，尚有凋亡细胞和凋亡小体的存在。5 联合治疗组与e x o s o m e s 瘤苗组荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数明显高于对照组，单独顺铂对免疫器官影响不显著。顺铂化疗后联用E x o s o m e s 瘤苗，荷瘤鼠脾指数、胸腺指
7、数分别为( 9 9 6 + _ 0 9 1 ) m g g和( 3 5 1 - - + 4 7 9 ) m g g ，与对照组比较明显提高( 尸 0 0 5 ) ，E x o s o m e s 组和顺铂联合e x o s o m e s 组小鼠脾淋巴细胞S I 明显大于对照组( 氏O 0 5 ) ，顺铂化疗后联合e x o s o m e s 组脾淋巴细胞S I 与单独e x o s o m e s 组差异显著( 氏O 0 5 ，图2 - 4 ) N s x 寸照组E x o s o m e s 组顺铂组联合组图2 - 4 脾淋巴细胞增殖活性F i g2 - 4P r o l i f e r
8、 a t i o no fL y m p h o c y t eBBI丑田10H 艚重庆医科大学硕士研究生学位论文2 6 顺铂化疗联合e x o s o m e s 瘤苗对C T L 杀伤作用的影响在效靶比为2 0 ：1 、4 0 ：l 和8 0 ：l 时，顺铂联合e x o s o m e s 瘤苗组特异性C T L对靶细胞H 篮的杀伤率依次为4 6 5 、6 0 8 9 6 和8 0 6 ；单独e x o s o m e s 瘤苗组为3 1 2 、4 4 2 和6 0 9 ；顺铂组为3 1 、6 0 和1 1 7 ；对照组依次为4 8 、8 7 和1 6 1 。顺铂化疗后联合e x o s
9、 o m e s 瘤苗组与单独e x o s o m e s 瘤苗组比较差异显著( P 0 0 5 ，图2 - 5 ) 。团胃S 财院组I L - 2I l q F 一丫图2 - 5 荷瘤鼠血清I L - 2 ，I l f F v 水平F i g2 - 5C o n c e n t r a t i o no fs e r u mI L - 2a n dI N F - 丫i nt u m o r - b e a r i n gB A L B 托m i c e3 讨论化疗药顺铂对免疫系统有着直接的破坏作用，但免疫系统对这种损害作用有一个代偿反应途径，以抵抗这种破坏作用，来维持自身免疫系统的稳定性。
10、因此，在这种情况下免疫系统不至于形成单纯的免疫抑制状态【1 1 。肿瘤细胞源e x o s o m e s 瘤苗( T E X s ) 承载着一套肿瘤的共同抗原，并富含热休克蛋白( h e a t - s h o c kp r o t e i n s ，H S P ) 7 0 - 9 0 ，M H CI 类分子等，有希望成为一种新的3 8OOOO00OO0OO怕弱钟：。加垮加o1II【兰一删扣重庆医科大学硕士研究生学位论文亚细胞肿瘤疫苗【8 1 。本实验采用d , 弃a J 量化疗药顺铂( 2 m g k g ，小鼠顺铂的最大耐受剂量为9 m g k g 2 5 1 ) 与H 2 2 源e x
11、 o s o r n e s 瘤苗有机结合( 化疗药物顺铂作用消失后，免疫细胞数降至最低或开始恢复时实施) 治疗小鼠H 2 2 移植瘤，观察二者有无叠加或协同的抗肿瘤效应。初步结果显示：化疗和肿瘤疫苗单独使用，均有一定的抑制肿瘤生长作用，而且联合应用在抑制肿瘤生长方面起协同作用，效果显著优于单一疗法，该结果与T a i e b 等【2 6 】的发现相一致。肿瘤组织超微结构观察可见，联合治疗组肿瘤细胞胞质密度增高，核缩小，同时可找到类圆形的凋亡小体，内含线粒体等细胞器结构，这些改变都有别于坏死，与细胞凋亡的形态学改变相符，提示诱导肿瘤细胞凋亡是顺铂与e x o s o m e s 瘤苗联合应用体
12、内抑瘤活性的机制之一。C h u等【27 】研究还发现肿瘤疫苗免疫后应用化疗并没有获得抗肿瘤效应，分析原因可能是化疗药物对肿瘤免疫应答诱生免疫细胞的直接细胞毒作用，从而抑制了免疫应答效应。免疫系统是一个由各种相互影响的组分构成的复杂网络，在抗肿瘤免疫反应年，细胞免疫占主导地位2 酊，肿瘤抗原活化淋巴细胞，使其发生增殖分化，形成细胞毒性T 淋巴细胞( c y t o t o x i cTl y m p h o c y t eC T L ) 和辅助性T 细胞等，前者作为抗肿瘤免疫的主要效应细胞，对肿瘤细胞产生直接或间接杀伤作用，后者通过分泌I L - 2 、M - 丫等细胞因子来促成C T L 作
13、用实现。本实验检测了小鼠脾和胸腺增殖指数、脾淋巴细胞增殖能力、脾淋巴细胞对H 2 2 细胞的生长抑制作用以及分泌I L 一2和M 吖的能力，可以基本反映出小鼠的抗肿瘤免疫功能。脾脏是机体进行免疫反应的主要场所，胸腺在免疫系统中也占有极为重要地位，它是c D 4 + T 细胞分化和发育的主要场所，本实验通过对荷瘤小鼠的脾脏和胸腺指数的比较，发现联合化疗药顺铂与e x o s o m e s 瘤苗显著提高荷瘤小鼠的脾脏和胸腺指数。而且顺铂与e x o s o m e s 瘤苗联合应用可促进荷瘤鼠脾淋巴细胞增殖反应和C T L 细胞毒活性，提示化疗与肿瘤疫苗联合应用可通过调节机体的免疫力，刺激T细胞
14、的功能来达到杀伤肿瘤细胞的目的。曾有报道【2 9 】通过小鼠体内淋巴细胞亚群清除实验，也发现将C D 8 + T 淋巴细胞耗竭后，顺铂或环磷酰胺联合牛痘病毒疫苗治疗抗肿瘤作用消失，也说明联合疗法致肿瘤消退，与抗原特异性C D 8 + T 淋巴细胞的免疫效应有关。I L 2 的形成需要活化的T 淋巴细胞，而l L 2 发挥抗肿瘤作用又是通过促进T3 9重庆医科大学硕士研究生学位论文细胞增殖及其对肿瘤细胞的杀伤作用、诱导L A K 细胞、促进B 细胞增值及分泌抗体、活化N K 细胞等来实现的【3 0 1 ，外周血I L 一2 水平可以反映出肿瘤患者机体的免疫水平和抗肿瘤能力【3 1 】；I N F
15、 Y 也主要是由活化的T 细胞和N K 细胞产生，通过促进C T L 成熟及活性、B 细胞分化、促进多种细胞表达M H CI 类和I I 类分子、激活巨噬细胞、中性粒细胞、N K 细胞功能等发挥生物学活性【3 2 】。本实验通过对各组荷瘤鼠血清细胞因子检测发现，e x o s o m e s 瘤苗接种后血清中I L 一2 和I N F - ? 水平显著增高，联合组血清中I L - 2 和I N F - 7 水平更高。但顺铂单独使用对其水平影响不显著，这也与寻常的推测不同。综上所述，本实验初步证实顺铂化疗后与e x o s o m e s 联合应用治疗小鼠肿瘤有协同作用，联合疗法既未使e x o
16、 s o m e s 瘤苗免疫原性受累，也没有产生免疫耐受，反而增强了抗肿瘤特异性免疫效应，显著抑制肿瘤生长，实验动物也未见明显毒副反应。本研究结果部分修正了以往认为化疗削弱了免疫功能，不能进行肿瘤疫苗主动免疫的观点，提出在化疗后进行肿瘤疫苗的主动免疫可以诱生出较强的抗肿瘤免疫。但我们仍应清楚地认识到，动物试验和临床实际情况之间尚有很大距离，如何制定规范化、个体化、毒副作用小的化疗联合肿瘤疫苗治疗方案是今后需致力研 究的课题。重庆医科大学硕士研究生学位论文全文总结本文在体外细胞培养，体内动物实验研究的基础上，深入地观察了小剂量顺铂联合H 2 。细胞分泌的E x o s o m e s 瘤苗对小鼠肝癌H ：。细胞的抑制作用，并探讨了其主要的作用机制，证明：( 1 ) 在体外实验中，顺铂能上调H ：细胞表面F a s 表达，E x o s o m e s 瘤苗免疫后小鼠脾淋巴细胞F a s L 表达
