《脂肪酸甲酯分析色谱柱的选择应用报告》由会员分享，可在线阅读，更多相关《脂肪酸甲酯分析色谱柱的选择应用报告（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、作者Frank David Research Institute for Chromatography President Kennedy Park 20 B-8500 Kortrijk, BelgiumPat Sandra University of Gent Krijgslaan 281 S4, B-9000 Gent BelgiumAllen K. Vickers Agilent Technologies, Inc. 91 Blue Ravine Road Folsom, CA 95630-4714 USA摘要食品中的脂肪酸甲酯（FAME）的分析对食品的表征过程是十分重要的，正常情况下脂
2、肪酸甲酯的分析使用涂渍极性固定相色谱柱，例如聚乙二醇或氰丙基聚硅氧烷固定相，这种固定相可以按脂肪酸的碳数、不饱和度、顺反构象以及双键的位置对它们进行分离。脂肪酸甲酯分析色谱柱的选择应用报告本应用报告比较三种不同固定相对脂肪酸甲酯的分离的情况。聚乙二醇柱对不太复杂的样品可以得到很好的分离；但不能分离顺-反异构体的样品。而中等极性的氰丙基聚硅氧烷柱（DB23）对复杂的FAME 混合物可以得到很好的分离，对一些顺反异构体也可以得到分离; 要使顺反异构体分离的更好，就要使用更高极性的HP-88 氰丙基色谱柱。前言FAME 的分析用于食品中脂类部分含量的表征，也是 食品分析中极为重要的一项内容，脂类主要
3、包括甘油 酸酯，它们是一个甘油分子和三个脂肪酸分子的酯， 绝大多数食用脂肪和油主要含有的脂肪酸是从月桂酸 （十二碳酸）到花生酸（二十碳酸） ，除直链饱和脂肪 酸外，也有支链脂肪酸、单不饱和脂肪酸、双不饱和 脂肪酸以及多不饱和脂肪酸。表 1 是最重要的脂肪酸 及其的缩写。食品分析2为了表征脂类组分的含量，把甘油三酸酯水解（皂化） 成为甘油和三个游离脂肪酸，虽然游离脂肪酸可以直 接在极性固定相上（例如 HP-FFAP 柱）进行分析， 但是如果把脂肪酸衍生化为脂肪酸甲酯就可以得到更 为可靠和重复性的色谱数据。包括水解和甲酯化的衍 生化有各种不同的方法 1，这些方法很容易使用， 也不需要昂贵的试剂。典
4、型的样品制备方法会在样品 制备一节里叙述。在脂肪酸甲酯制备好以后，脂肪酸甲酯就会按碳数 （在脂肪酸链上的碳数，包括甲酯的碳数）和不饱和表1.脂肪酸、通用名称及其缩写脂肪酸通俗名称缩写 丁酸丁酸C4:0癸酸癸酸C10:0十二烷酸月桂酸C12:0十四烷酸肉豆蔻C14:0十六烷酸棕榈酸C16:0十六烷烯酸棕榈油酸C16:1十八烷酸硬脂酸C18:0顺-9-十八烯酸油酸C18:1- cis (n9)反-9-十八烯酸反油酸C18:1- trans (n9)全顺-9, 12-十八碳二烯酸亚油酸C18:2 - cis (n6)全反-9, 12-十八碳二烯酸反亚油酸C18:2 - trans (n6)全顺-9,
5、 12, 15-十八碳三烯酸-亚油酸C18:3 (n3)全顺-6, 9, 12-十八碳三烯酸- 亚油酸C18:3 (n6)二十烷酸花生酸C20:0顺-11-二十碳烯酸C20:1 (n9)全顺-11, 14-二十碳二烯酸C20:2 (n6)全顺-11, 14, 17-二十碳三烯酸C20:3 (n3)全顺-8, 11, 14-二十碳三烯酸Dihomogammalinolenic acidC20:3 (n6)全顺-5, 8, 11, 14-二十碳四烯酸花生四烯酸C20:4 (n6)全顺-5, 8, 11, 14, 17-二十碳戊烯酸EPAC20:5 (n3)二十二碳酸山芋酸C22:0顺-13-二十二
6、碳烯酸芥酸C22:1 (n9)全顺-7, 10, 13, 16-二十二碳四烯酸C22:4 (n6)全顺-4, 7, 10, 13, 16, 19-二十二碳己烯酸DHAC22:6 (n3)二十四烷酸二十四酸C24:0顺-15-二十四碳烯酸神经酸C24:1 (n9)度进行分离，而且，双键的位置和几何构象（顺/反） 也是重要的参数，对其测定就增加了对食品中脂类组 分表征的信息。在这一应用报告中，比较了三种固定相对 FAME 分 离的性能。第一个方法使用 DB-Wax，聚乙二醇色谱 柱，在这一固定相上 FAME 从 C4（丁酸）到 C24 （二十四酸）可以按碳数和不饱和度得到分离。在这 一类色谱柱上顺
7、，反式异构体不能分离开，并且对复 杂的混合物如鱼油，某些 FAME 难以分离，但是， 在聚乙二醇色谱柱上分离 FAME 得到广泛应用，并3用于表征“标准”的样品，如谷物玉米、橄榄和大豆 中的植物油。而且也可以分析动物脂肪。分析牛奶脂 肪中的丁酸是一项重要应用。牛奶中的丁酸浓度是它 的一个重要质量指标，所以，分析牛奶、奶制品、巧 克力产品中的丁酸非常重要。为了分析复杂的样品，例如鱼油，还需要对 FAME 有额外的分离度， 使用涂渍氰丙基固定相的毛细管柱， 例如 DB-23，有这样的能力，在 DB-23 柱上高不饱 和度的脂肪酸，例如全顺-5，8，11，14，17-二十碳 戊烯酸甲酯（EPA，C2
8、0:5 3） ，和全顺-4，7，10， 13，16，19-二十二碳己烯酸（DHA，C22:6 3）可 以和其他脂肪酸甲酯分离开。这一分析在当今令人关 注的 omega-3 脂肪酸分析计划中十分重要。在氰丙基 柱上也可以分离顺-反异构体，由于分离顺式-异构体 和氰基偶极的作用力较强，反式异构体比顺式-异构 体较前洗脱出来，这样就可以测定反式脂肪酸了，但 是氰丙基固定相的极性还不够，不能把复杂的顺-反 异构体混合物完全分离。为了分离含有大量的反式脂肪酸复杂的 FAME 混合 物，推荐使用极性更强的 HP-88 色谱柱，在这一高极 性色谱柱上，可以很好地分离不同的顺-反异构体， 但是一些更高分子量的
9、脂肪酸分离要更困难一些。在图 1 中总结了各种色谱柱及其应用领域的概况。实验样品FAME 的参考标准样品溶液来源于不同的渠道，或使 用纯化合物，用于分析的标准溶液，通常溶于己烷， 浓度为 0.01%0.1%（w/v） 。为了校验色谱柱，使用一个含有 37 个组分的混合物 （Supelco #18919） ，这是一个含有 100 mg 纯净物质的 混合物，包含 C4C24 的 FAME（相对浓度为 2%4%） 。使用前所有样品在 10 mL 己烷中稀释（每 种 FAME 最后的浓度 = 0.20.4 mg/mL） 。油和脂肪样 品可使用不同的方法制备 15。样品制备方法5称取 100 mg 样品
10、到 20 mL 试管（带螺口盖）或反应 瓶中，使样品溶于 10 mL 己烷，加 100 L 2 N 氢氧 化钾甲醇溶液（100 mL 甲醇中 11.2 g KOH） 。把试管 或反应瓶盖上，旋转摇动 30 秒，离心，把上清液转 移到 2 mL 自动进样器的样品瓶中。分析条件在带有火焰离子化检测器（FID）的 Agilent 6890 GC 上进行分析，使用 Agilent 7683 自动进样器进行自动 分流进样。仪器的设置和分析条件总结在表 2（DB- Wax 柱)，表 3（DB-23 柱）和表 4（HP-88 柱）中。图1.FAME 分析色谱柱选择概况4表2.DB-Wax 柱方法1仪器 色谱
11、系统：Agilent 6890 GC 进样口分流/不分流 检测器FID 或Agilent 5973 MSD 自动进样器Agilent 7683 衬管分流衬管（部件号5183-4647） 色谱柱30 m x 0.25 mm ID，0.25 m DB-Wax（J 空气450 mL/min; 氦做尾吹气: 30 mL/min。表3.DB-23 柱方法2仪器 色谱系统：Agilent 6890 GC 进样口分流/不分流 检测器FID 或Agilent 5973 MSD 自动进样器Agilent 7683 衬管分流衬管（部件号5183-4647） 色谱柱60 m x 0.25 mm ID，0.15 m
12、DB-23（J 空气450 mL/min; 氦做尾吹气: 30 mL/min。表4.HP-88 柱方法3A 和3B仪器 色谱系统：Agilent 6890 GC 进样口分流/不分流 检测器FID 或Agilent 5973 MSD 自动进样器Agilent 7683 衬管分流衬管（部件号5183-4647） 色谱柱A100 m x 0.25 mm ID，0.2 m HP-88（J 空气450 mL/min; 氦做尾吹气: 30 mL/min。5结果在 DB-Wax 柱上分析 37 种组分 FAME 参考标准样的 典型色谱如图 2 所示。051015Time (min)202530Norm.20
13、30405060708090100C4:0C6:0C8:0C10:0 C11:0 C12:0 C13:0 C14:0C14:1 C15:0C15:1 C16:0C16:1 C17:0 C17:1C18:0C18:1 c+t C18:2 c+t C18:3 n6 C18:3 n3C20:0C20:1 C20:2C20: 3n6 + C21:0C20:3 n3 C20:4 C20:5C22:0 C22:1C22:2 C23:0C24:0C22:6 + C24:1DB-wax图2.37 种FAME 参考标准样混合物在30 m x 0.25 mm ID，0.25 m DB-Wax 色谱柱上的GC-FI
14、D 分析，使用方法1（见表2）除下列化合物外，其它化合物都能得到很好的分离： 顺-和反-C18:1 在 14.38 min 处一起洗脱出来。顺-和 反-C18:2 在 15.13 min 处一起洗脱出来。C20:3 n6 和 C21:0 19.44 min 处一起洗脱出来。以及 C22:6 和 C24:1 在 30.73 min 处一起洗脱出来。但是，这样的 分离对一些经典的油和脂肪的表征方法已经足够了， 丁酸在 4.28 min 洗脱出来，这一方法可以用于牛奶中 脂肪的测定。这一点可以在图 3 中得到证明，它是对 有证牛奶脂肪标准物质 (CRM 164，6) 的分析。6Time (min)N
15、orm.2030405060708090100C4:0C6:0C8:0C10:0C12:0C14:1C15:0C15:1C16:1C17:0C18:0C18:2 c+t C18:3 n346810121416C14:0C16:0C18:1 c+t DB-wax图3.对牛奶脂肪CRM 164 脂肪酸在30 m x 0.25 mm ID，0.25 m DB-Wax 柱上的GC-FID 分析（使用表2 中的方法1）在 60 m0.25 mm ID，0.15 m DB-23 柱上分析 37 种 FAME 混合物的色谱，如图 4 所示。Time (min)46810121416182022Norm.20
16、30405060708090100C4:0C6:0C8:0C10:0C11:0C12:0C13:0C14:0C14:1 C15:0 C15:1C16:0C16:1C17:0 C17:1C18:0C18:1, transC18:1, cisC18:2, trans C18:2, cis C18:3 n6 C18:3 n3 C20:0 C20:1n9C20:2C21:0C20:3 n6C20:4 n6C20:3 n3C22:0C20:5C22:1C22:2 C23:0C24:0 C24:1C22:6DB-23图4.对FAME 标准脂肪酸混合物在60 m x 0.25 mm ID，0.15 m DB-23 柱上的GC-FID 分析（使用表3 中的方法2）7使用这些条件对标准混合物中的所有成分都可以很好 地分离，顺/反异构体以及 EPA (19.15 min) 和 DHA (22.38 min) 混合物的分离也得到改善。这一方法对复 杂混合物的脂肪酸分离很有用，特别是对 omega-3 脂 肪酸 (如 EPA 和 DHA) 的检测有用。图
