微生物学及检验技术

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1、第一章第一章 卫生检验综合知识卫生检验综合知识“中华人民共和国计量法中华人民共和国计量法”是 1985.9.6 由中华人民共和国第二十八号主席令公布的，自 1986.7.1 起施行。计量法中有关的条文有：计量法中有关的条文有：第五条：国务院计量行政部门负责建立各种计量基准器具，作为统一全国量值的最高依据。第八条：企业、事业单位根据需要，可以建立本单位使用的计量标准器具，其各项最高计量标准器具经有关人民政府计量行政部门有关人民政府计量行政部门主持考核合格后使用。第二十二条：为社会提供公证数据的产品质量检验机构产品质量检验机构，必须经省级以上人民政府计量行政部门省级以上人民政府计量行政部门对其计量

2、检定、测试的能力和可靠性考核合格。计量法实施细则：计量法实施细则：1987 年国家计量局发布的“中华人民共和国计量法实施细则”其中：第三十二条：为社会提供公证数据的产品质量检验机构产品质量检验机构，必须经省级以上人民政府计量行政部门省级以上人民政府计量行政部门计量认证。计量认证：计量认证：本规范经国家技术监督局于 1990 年 7 月 20 日批准，并自 1990 年 11 月 1 日起施行。卫生部于卫生部于 1981 年发布的年发布的卫生标准管理办法卫生标准管理办法第一条规定：第一条规定：卫生标准是国家的一项重要的技术法规，是进行预防性和经常性卫生监督的重要依据。卫生标准可分为：卫生标准可分

3、为：强制性标准和推荐性标准；又分为国家标准、行业标准、地方标准和企业标准。国家标准以国家标准以“GB”表示，国家推荐性标准以“GB/T”表示；卫生部发布的卫生行业标准以卫生部发布的卫生行业标准以“WS”表示，推荐性标准表示为“WS /T” 。卫生标准制定状况：卫生标准制定状况：建国后最早颁发的卫生标准是在 1953 年；正式列入国家标准编号的第一个卫生标准是 1956 年颁发的“工业企业设计暂行” 卫生标准；到 1996 年底，我国已有卫生国家标准 1200 项，到 2004 年止，与劳动卫生标准配套的标准方法已有 249 多个；与环境卫生标准配套的居民区大气标准方法已有 20 多个；与食品卫

4、生标准配套的标准方法，其中理化检验方法已有 70 多个，微生物学检验方法已有 30 多项。我国的卫生标准由我国的卫生标准由“全国卫生标准技术委员会”及其专业委员会负责制定和评审，又国家质量技术监督局和卫生部审批。中华人民共和国传染病防治法：中华人民共和国传染病防治法：1989 年 2 月 21 日第七届全国人民代表大会常务委员会第六次会议通过。2004 年 8 月 28 日第十届全国人民代表大会常务委员会第十一次会议修订。中华人民共和国传染病防治法：中华人民共和国传染病防治法：共 79 条 本法自 2004 年 12 月 1 日起施行。传染性非典性肺炎：传染性非典性肺炎：（简称为非典性肺炎，A

5、P）是指 2002 年 11 月起，我国局部地区发生的、主要以近距离空气飞沫和密切接触传播为主的呼吸道传染病，临床主要表现为肺炎，在家庭和医院有显著的聚集现象。世界卫生组织世界卫生组织于 2003 年 4 月 16 日，在 13 个 WHO 网络会议上宣布一种新的冠状病毒是 DNASARS 的病毒，从而为 SARS 防止提供了依据。第三章第三章医学分子生物学医学分子生物学（一）（一） 、病毒的概念：、病毒的概念：病毒是一类体积微小、结构简单、具有严格的寄生于活细胞的微小生物，它们具有下列几种基本特征：1、病毒的基本结构是由核酸（基因组）核酸（基因组）与蛋白质组成蛋白质组成，由 DNA 或 RN

6、A 组成核心，外有一蛋白外壳（核壳） ，有些病毒在核壳外面另有一层脂蛋白组成的包膜包围着。2、病毒只在活细胞中增殖只在活细胞中增殖，因为病毒缺乏完整细胞器等必要装置，所以必须依赖宿主细胞提供高分子合成装置和能量。3、病毒非常微小，无细胞结构，绝大多数不能用不能用光学显微镜检查，而必须用电子显微镜才能察见必须用电子显微镜才能察见。第一节核酸基本知识：第一节核酸基本知识：一、一、核酸化学：核酸化学：DNA 是脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸的英文缩写。RNA 与 DNA 差别在核糖核糖 2 2，位带有一个羟基。DNADNA DNA 起储存遗传信息作用，并以核苷酸排列顺序核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。由

7、4 种核苷酸组成 DNA 分子，由碱基互补维持 DNA 双螺旋结构。在动植物、细菌、真菌中都含有 DNA，但在病毒中（非细胞型微生物非细胞型微生物）不一定含 DNA。DNA 为长丝状分子互相纠缠（jiuchan） ，其溶液十分粘稠溶液十分粘稠。它对紫外线有最强的吸收，通常用 260nm 波长测 DNA 溶液浓度，它在近中性环境中带负电核，DNA 变性后 OD 值会升高。因 DNA 不溶于乙醇，常用二倍量沉淀 DNA 在变性温度时，它的粘性突然降低粘性突然降低。 淬火是为了保持 DNA 单链状态。DNA 变性后溶液慢慢冷却，DNA 会自动恢复双螺旋结构。说法错误的：说法错误的：（1）DNA 和

8、RNA 的化学结构碱基 G 与 C 通过 2 对氢键配对构成 DNA 分子说法错误的。（2）与 DNA 分子相比，RNA 分子难水解的看法也不对。 （3）许多质粒可在宿主之间进行转移的说法是不对的。 （注意）形状：形状： （1）tRNA 二级结构呈三叶草形。 （2）在细胞内 RNA 分子中 rRNA 占比例最大。 （3）DNA 二级结构中呈左手双螺旋的是 Z 构象。DNADNA 结构、性质：结构、性质：在真菌中网崎片段一般为 100200 核苷酸。噬菌体核酸最常见的是双链线状双链线状 DNADNA。反式作用因子具有的 DNA 识别或或 DNA 结合域，主要有 螺旋/转折/螺旋（T/H/T）,锌

9、指结构，碱性-亮氨酸拉链（bZIP） ，碱性-螺旋/环/螺旋（bH/L/H） 。真核生物中的端粒酶端粒酶是由 RNARNA 和蛋白质构成的和蛋白质构成的。一般真核生物染色体上有 5 种主要的组蛋白组蛋白，其中亲和力最强的两种是 H H3 3 H H4 4 。二、二、DNADNA 的复制和修复：的复制和修复：（1）细胞每分裂一次，染色体 DNA 就合成一次，新 DNA 是按原 DNA 分子合成。（2）DNA 分子拆（ca）开成两条链，依每一条单链合成一条新单链，成为半保留复制。（3）在合成 DNA 时限制性限制性核酸内切酶不是合成 DNA 的必要条件。（4）DNA 多聚酶多聚酶只能结合在一长段

10、DNA 单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始 DNA 合成。（5）在 DNA 合成中单核苷酸单核苷酸分子必须顺序以共价链共价链连接在已形成核酸链 3，末端的羟基上。（6）在合成发生错误时，DNA 多聚酶多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。（7）在人工合成 DNA 时，只加一种或两种三磷酸单核苷酸三磷酸单核苷酸，那么合成就会停止在缺失的核苷酸位置上。在大肠菌在大肠菌 DNADNA 损伤损伤修复修复时填补缺口最重要的酶酶是 DNA 聚合酶。DNA 三个终止密码子分别是 UAA、UAG、UGA。在大肠菌中在大肠菌中 DNADNA 复制复制最主要的最主要的 DNA 聚合酶是

11、DNA 聚合酶。该酶的核心聚合酶中，具有 3 3， - - 5 5，外切酶活性的亚基是 亚基。在体内染色 DNA 复制复制时必须有 RNA 引物。在哺乳动物细胞中负责合成线粒体 DNA 是 DNA 聚合酶聚合酶 r r。RNA 酶 Tl 可特异地作用于嘌呤核苷酸 3，端磷酸并切割与相邻核苷酸相连的磷酸二酯键。体内 DNA 复制复制与体外 PCR 不同的是引发酶参与不同的是引发酶参与。与体内 DNA 复制复制不相关酶是反转录酶不相关酶是反转录酶。在细胞内 DNA 合成正常进行是 RecA 蛋白，而 RecA 蛋白不具有蛋白酶活性。在大肠菌在大肠菌 DNA 聚合酶 klenow 片段没有 5 5，

12、 - - 3 3，外切酶活性。DNA 修复过程中尿嘧啶 糖基酶系统不包括不包括 Sl 核酸酶。在逆转录酶的 RNAaseH 活性是一般 DNA 聚合酶所不具备的。在逆转录酶的最终产物双链 DNA 的长度较正链 RNA 稍长。三、转录：三、转录：在生物体内，RNA 合成过程称为转录。它（RNA）是按照储存在 DNA 上遗传信息合成。合成 RNA 时 DNA 双链也要解旋，解旋部位称启动子解旋部位称启动子。去掉去掉 RNARNA 分子分子 5 5，末端的磷酸末端的磷酸，不起合成酶功能的作用。在刺激点突变在刺激点突变，改变某些基因功能与 DNA 向 RNA 转移无直接关系（？）（1） 大肠菌的大肠菌

13、的 RNARNA 聚合酶由聚合酶由 5 5 个亚基个亚基，其 亚基有启动子作用。（2） 利福平作用该酶（聚合酶）（聚合酶） 亚基上。（3） RNARNA 聚合酶聚合酶主要是转录 rRNArRNA（构成核糖体骨架的是 rRNArRNA） 。 Prt-mRNA 内含子的 5，- 末端一般是 GU。（4） RNARNA 聚合酶聚合酶主要是转录 hnRNA。在真核基因启动子近侧序列元件中，对转录起点定位起关键作用的是 TATA 盒。（5） 放线菌素 D 能抑制 DNA 转录。编码核糖体 RNA 的基因是一种中度重复序列中度重复序列的 DNA 序列。四、翻译：四、翻译：在合成各种不同 RNA 中：（1）

14、 tRNA 具有搬运氨基酸功能。构成核糖体骨架的是 rRNA。 mRNA 直接决定蛋白质的结构。（2） 合成蛋白质需 4 种核苷酸核苷酸，排列组成遗传信息，然后转换成 20 种氨基酸，组成遗传信息称为翻译翻译。（3） 3 个核苷酸核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种。（4） 在细菌里，依靠 rRNA 和 mRNA 之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。（5） 在核糖体上，有两个位置上暴露出 mRNA（直接决定蛋白质的结构）分子相邻的两个密码子，当蛋白质合成进行到没有携带任何一种氨基酸 tRNA（具有搬运功能）与其对应，这说明合成蛋白质结束这说明合成蛋白质结束，

15、并已开始同一种蛋白质分子的合成。（6） 合成蛋白质后，决定其空间结构的是蛋白质的氨基酸排列顺序确定后，就能自动折叠卷曲成一定的空间形状。（7） 在原核生物核糖体在原核生物核糖体是由 16 SrRNA、23 SrRNA、5 SrRNA 组成，在真核生物核糖体在真核生物核糖体的五种主要的组蛋白中，H1 在进化中最不保守。五、基因表达调空：五、基因表达调空：（1）氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。（2）在基因 5，上游基因内或或其 3，下游序列中存在，能提高同一条 DNA 链上靶基因靶基因转录速率的遗传控制元件是增强子增强子。（3）乳糖操纵子中结构基因是 LacA、LacY、Lac

16、Z。六、遗传重组：六、遗传重组：转座子的功能有（1）促进染色体重排， （2）促进基因重复， （3）促进基因扩增， （4）造成缺失突变。在大肠遗传重组中，同源重组需 RecA 蛋白质。第二节实验技术：一、核酸提取、纯化、浓缩第二节实验技术：一、核酸提取、纯化、浓缩用煮沸法从表达内切酶 A 的大肠菌小量制备质粒时不能省略酚-氯仿抽提。用煮沸法制备质粒所用溶菌酶液是用 TrisCL 配制的。1 12 2用乙醇沉淀溶于 SDS 中 RNA 时，要避免用乙酸钾。小量制备 DNA 时不被限制酶切开，应用酚-氯仿抽提。3 34 4用异丙醇沉淀核酸与用乙醇相比，最明显优点是可减少溶液体积。5 51、质粒质粒 DNADNA 提取：提取：在用碱碱裂解法少量提取质粒 DNA 时，在缓冲液（液）中不含 SDS。多数质粒在自然状态下是环状链 DNA。质粒质粒 DNADNA 纯化方法有纯化方法有：离子交换层析；聚乙二醇分级沉淀；二凝胶过滤层析；氯化铯（se）- 溴化乙锭梯度平衡离1