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1、Shaanxi University of Chinese Medicine 硕士学位论文疏筋解毒汤干预疏筋解毒汤干预 PDPD 大鼠黑质内质网大鼠黑质内质网应激的实验研究应激的实验研究中文摘要目的：探讨疏筋解毒汤对帕金森病(PD)模型大鼠脑内黑质多巴胺能神经元内质网应激信号传导蛋白基因表达的调节作用。方法：采用向大鼠黑质内定位注射 6-OHDA 法制备 PD 大鼠模型。用正常 SD 大鼠作为空白对照组，并将造模成功的大鼠分为模型组、西药治疗组、疏筋解毒汤小剂量治疗组、疏筋解毒汤中剂量治疗组、疏筋解毒汤大剂量治疗组，共 6 个组。利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法对各实验组大鼠黑质的 C
2、HOPmRNA、XBP-1mRNA表达进行分析，检测各个指标在各组中的表达情况。结果：1、CHOPmRNA 表达：中药组 CHOPmRNA 的表达从 14d 到 60d 的用药过程中，随时间的延长，CHOPmRNA 的表达呈渐降趋势。且在 14d、21d、30d、45d、60d 5个时间点均低于西药治疗组和模型对照组，有统计学意义（P210r/30min（平均7r/min） ，连续4周诱发旋转速度稳定。2.4 灌胃、取组织疏筋解毒方组成：龟板、阿胶、鸡血藤、熟地、白芍、全虫、甘草等组成。诸药经生物学鉴定，符合 2010 版药典质量规定标准。利用人和动物间按体表面积折算的等效剂量法计算大鼠的用药
3、剂量（g/kg）=人每天的中药剂量（g/kg）6.25（人的体重按 60kg 计算） 。成人一日疏筋解毒方剂量为 121g，可以计算出大鼠日用药剂量为：12.6g/kg。灌胃的标准浓度为每毫升含生药 1.9g。左旋多巴：按照人和动物间按体表面积折算的等效剂量法计算给药剂量，大鼠每日用药剂量为：50mg/kg，粉碎后加入生理盐水配制成所需浓度的悬混液，用时摇匀，现配现用。不同组别灌胃：陕西中医学院 2012 届硕士学位论文20(1)空白对照组：灌服生理盐水。(2)模型对照组：灌服生理盐水。(3) 西药治疗组：灌服左旋多巴，按照人与动物剂量换算方法确定大鼠灌胃剂量0.05gkg-1d-1。(4)
4、中药组：分大、中、小剂量三个组。疏筋解毒方中药水煎剂灌胃，按照人与动物剂量换算方法确定灌胃剂量分别为大剂量组为：25.2gkg-1d-1，中剂量组为：12.6gkg-1d-1，小剂量组为：6.3gkg-1d-1。灌胃开始后第14、21、30、45、60d，分5个时间点分批处死动物(每组每批三只大鼠，空白组两只)，取出右侧黑质纹状体，保存于-80冰箱内保存。3 RT-PCR 过程3.1主要试剂配制(1)浸泡器具用的 1DEPC 水：1000mL 双蒸水中加 DEPC1mL，容量瓶中充分摇匀混合后静止 4 小时后备用（DEPC 有强致癌性，操作中注意通风，且极易挥发，需要用较大的针头才能够吸取）
5、。逆转录用的 1DEPC 水：100ml 盐水瓶中装 40ml 双蒸水，加 40 微升DEPC，37过夜，高压灭菌后分装到几个 1.5mlEP 管中，-20冰箱备用。(2)75%乙醇：量取无水乙醇 75mL，加 DEPC 处理过的双蒸水 25mL，混合后放人-20冰箱备用。(3)PH8.0 的 EDTA 溶液：EDTA-Na37.2g 加入 160ml 蒸馏水中，在搅拌机上剧烈搅拌，部分难以溶解时先少量加入 NaOH 即溶，后用 NaOH 调节 PH 值（约总需7.5gNaOH） 。用蒸馏水定容至 200ml。然后高压灭菌后室温保存。(4)5TBE(pH8.0)电泳缓冲液：与 TAE 液比较有
6、缓冲能力强，分辨率高的优点。称取 Tris-base54g，硼酸 27.5g，EDTA 液 20mL，加水至 1L，作为储备液，电泳时稀释成 0.5TBE 应用液。通常取 50ml 加纯水 450ml，共 500ml,取 300ml 放入电泳槽电泳用，剩余用于制胶。(5)溴化乙锭（EB）：称取 EB0.2g 溶于 20mL 双蒸水中，磁力搅拌数小时。然后用箔包裹容器室温保存。(6)引物溶解：根据合成厂家提供的引物溶解说明书，加入消毒的去离子水，配制成 100M 的储存液（母液） ，用时吸取需要量用消毒的去离子纯水稀释成终浓度疏筋解毒汤干预 PD 大鼠黑质内质网应激的实验研究21为 5M 的应用
7、液。3.2引物序列设计表 2. PCR 反应引物序列gene primer Length(bp)-actin Sense 5 GAGA CCTT CAAC ACCC CAGCC 3Antisense5 TCGG GGCA TCGG AACC GCTCA 3 373CHOP Sense 5 CCTT CACT ACTC TTGA CCCTG 3Antisense 5 CTCA TTCT CCTG CTCC TTCT 3 471XBP-1 Sense 5 ACTC ATGG GCTT GTGA TTGA GAAC 3Antisense 5 GGAT CTCT AAGA CTAG AGGT GGTG
8、 3 4833.3 实验步骤3.3.1 总RNA的提取用总RNA极速抽提试剂盒（RNAfast200），该试剂盒提取的RNA质量高，不同提取操作批次间变异小，而且污染少、速度目前最快。1、研磨组织：将组织块称重后放入研磨网中，加入生理盐水（10kb 浓度为 0.3-0.7%；0.5kbDNA10kb，胶浓度为 0.8-1.0%，本实验用 0.6g）琼脂糖，电炉上煮至沸腾，加热时应盖上容器盖，以减少水份蒸发。琼脂糖融化后，停止加热，冷却至60左右加入 10mg/mlEB5-10l，充分混匀后，立即将溶液缓慢倒入已放好梳子、胶带封好两端的电泳板中（注意不要将溶液表面形成的膜倒入，以免形成气泡） ，
9、室温下冷却约 45 分钟，胶凝固后，拔出梳子，去掉两端的胶带，将胶放到电泳槽中，有梳子孔的一端靠近负极方向（DNA 带负电荷） ，调整缓冲液的量，使胶块浸没在电泳缓冲液下约 1mm 处，准备加样。3.3.4.2 加样陕西中医学院 2012 届硕士学位论文24PCR Marker：5lPCR 样品：5l 样品 DNA1l Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。若样品 DNA 含量偏低，则可增加上样量，也可以更换梳子以改变样品槽的容积。每一个样品用一个 Tip 头，以防止互相污染，注意上样时要用另一只手协助操作，以避免刺入样品槽底部或侧壁。3.3.4.3电泳接通线路，打开电泳仪电源，为
10、防止样品扩散入缓冲液，在样品进入凝胶前可用略高的电压，样品入胶后，调整电压不高于 5V/cm(电压值 V/电泳槽正负极间的距离，电压不能过高，过高则电场强度大影响分子的分离)，通常在 90V 左右，电泳约1 小时。电泳缓冲液用久后浓度变大，电阻变小，相同电压下功率变大，缓冲液温度易升高而影响电泳结果（降低电泳图的清晰度） ，故应及时更换。3.3.4.4产物的半定量分析电泳结束后，取出凝胶块，在凝胶成像系统下观察电泳结果，拍照保存。用Smart View 软件对电泳条带扫描，并将扫描曲线放在同一个屏幕上进行比较观察；然后测定电泳条带的密度值，用待测基因片段的光密度值/内参基因的光密度值，得出待测
11、基因电泳条带密度的相对系数，得到目的基因的相对表达水平。3.4 实验结果3.4.1分析方法利用 RT-PCR 法检测 PD 模型大鼠脑内黑质细胞 CHOP 基因表达情况，用 -actin 作为内参基因。按不同时间点（14d、21d、30d、45d、60d）取组织进行测定。用凝胶成像系统对扩增产物电泳图进行紫外扫描、测定、分析，根据 CHOP/-actin 的比值判断产物的表达情况。用 SPSS17.0 软件对不同时间点目的基因光密度的相对系数进行统计分析。数据以均数标准差()表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用配对样本 t 检验， P0.05 为有差异、具有统计学意义，P0.
12、01 为有显著性差异。3.4.2疏筋解毒汤对PD大鼠黑质CHOPmRNA表达的影响结果表明，各组的 CHOPmRNA 表达均高于空白对照组，组间比较有显著差异(P0.01)。说明造模成功的大鼠黑质产生了内质网应激。经疏筋解毒汤（中剂量组）治疗的 PD 模型大鼠组的 CHOPmRNA 表达水平明显低于模型组和西药治疗组(P0.01)，且随治疗时间的增加，CHOPmRNA 表达水平渐降(P0.01)，说明疏筋解疏筋解毒汤干预 PD 大鼠黑质内质网应激的实验研究25毒汤可以通过降低凋亡因子 CHOP 的基因表达，从而抑制 PD 模型大鼠脑内黑质细胞的凋亡。中药治疗组的三个剂量组的差别是：中剂量组和大
13、剂量组的CHOPmRNA 表达低于小剂量组，组间比较有统计学意义（P0.05） ，中剂量组和大剂量组比较无差别。扩增产物电泳图及数据分析如下：bp M 1 2 3 4 5400-actin 500600300 CHOP400 图 2. 西药组：-actin（483bp） 、CHOP（373bp）RT-PCR 产物琼脂糖电泳结果：M：DNA Marker；1-5 为 14d、21d、30d、45d、60d 5 个时间点：CHOP 表达随时间的增加无明显变化。 表 3.西药组不同时段 CHOP RT-PCR 电泳结果的密度扫描分析()紫外扫描值 不同时间CHOP -actin CHOP/-acti
14、n14d 21.8521.010 34.5531.133 0.6330.00921d 22.1210.921 41.2441.119 0.5360.00830d 20.8141.112 41.7861.129 0.4980.01245d 22.7390.290 37.0961.002 0.6130.01060d 20.9100.386 37.9400.808 0.5510.006经 SPSS 17.0 对 5 组 CHOP/-actin 数据做单因素方差分析结果无差异。陕西中医学院 2012 届硕士学位论文26bp M 1 2 3 4 5300 400-actin 500600300 CHOP 400500图 3. 中药组（中剂量组）：-actin（483bp） 、CHOP（373bp）RT-PCR 产物琼脂糖电泳结果：M：DNA Marker；1-5 为 14d、21d、30d、45d、60d 5 个时间点。CHOP 随时间的增加表达减少。表 4.中药组不同时段 CHOP RT-PCR 电泳结果的密度扫描分析()紫外扫描值 不同时间CHOP -actin CHOP/-actin14d 16.4780.732 35.5251.309 0.4640.00521d 15.6060.583 40.4121.611 0.3860.00130d 15.4511.019 43.5501.5
