《牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（二）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（二）（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白 fimA 基因在大 肠杆菌中的融合表达和纯化（二）5）金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性在基因工程技术中，表达的重组蛋白多以包涵体形式存在，蛋白质经常会错误折叠而丧失活性，这一难题长久以来都没有得到很好的解决。高浓度的变性剂可以溶解包涵体，然后控制变性剂除去的速度，有时需要添加适当的氧化/还原试剂，蛋白质可以逐步折叠复性。通常使用的复性方法有三种，分别是稀释复性、透析复性和层析复性。（1）稀释复性：直接把溶解的蛋白质稀释于复性缓冲液中。这种方法操作简单，适于小规模使用，但只适于浓度极低的蛋白质复性，否则会有大量聚集体形成。（2）透析复性：采用透析膜通过逐渐降低外透液浓度
2、来控制变性剂去除速度。这种方法速度慢、耗时长，不适合大规模使用，有时易形成无活性蛋白聚集体。（3）层析复性：使蛋白质可逆吸附在固相介质上，例如离子交换层析介质、金属螯合亲和层析介质等，可以避免伸展的多肽分子之间形成聚集体。金属螯合亲和层析(IMAC)是一种有效的纯化和复性蛋白质的层析方法。在高浓度变性剂存在的情况下，组氨酸尾仍旧具有吸附在金属螯合亲和层析介质上的能力，所以可在IMAC 介质上同时实现复性与纯化112-116。蛋白质吸附在 IMAC 介质后，先逐步降低变性剂的浓度，使蛋白质折叠，然后提高咪唑浓度把折叠后的蛋白质洗脱出来。对于 TNF 蛋白，使用 IMAC 获得了 90%的复性收率
3、73。22.6 小结 大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解而成为表达许多异源蛋白质的首选表达系统。在过去的 20 多年中，用各种载体系统在大肠杆菌中表达了数百种重组蛋白。融合标签不但可提高重组蛋白的产量，还可增强重组蛋白质的可溶性。融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。随着金属螯合亲和层析技术的不断发展和改进，目前，固定化金属螯合亲和层析技术已成为蛋白质，特别是基因重组蛋白和多肽分离纯化最有效的工具之一。本课题组已成功构建了 Pg 菌毛蛋白 fimA 基因的原核表达质粒 pET-15b-fimA，本研究在此基础上，拟将此质粒在大肠杆菌 BL21(DE
4、3)pLysS 中表达，然后用固定化金属螯合亲和层析技术得到纯化的 FimA 蛋白，为下一步获取免疫血清、进一步研制具有实用价值的预防牙周炎的免疫疫苗提供实验基础。3 实验一 fimA 在大肠杆菌中的表达 3.1 实验材料与仪器 3.1.1 菌珠 1）大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS：北京天根生化科技有限公司。该菌株基因型为：F-，ompT，hsdSB(rB-mB-)，dcm(DE3)，gal，pLysS，Cam r，该菌珠所带 pLysS 具有氯霉素抗性。此质粒含有表达 T7 溶菌酶的基因，T7 溶菌酶能降低目的基因的背景表达水平，但不干扰 IPTG 诱导的表达。适于毒性蛋白和非毒性蛋
5、白的表达。2）携带有 pET-15b Vector 和 pET-15b-fimA 的大肠杆菌 TOP10（本课题组前期3实验获得）。其中 pET-15b Vector：原核表达载体，双链环状 DNA，由 5708 bp 组成，含有可插入外源基因的多克隆位点（MCS）、Amp 抗性基因、T7 lac、T7 promoter、lac operator、T7 terminator、N-末端 His-Tag（6 个组氨酸）。是一种组氨酸融合表达载体，这 6 个组氨酸标签便于用钴柱纯化或以抗组氨酸抗体筛选。pET-15b 载体读框及多克隆位点见图 3.1，其克隆、表达区见图 3.2。图 3.1 原核表达
6、载体质粒 pET-15b 图谱图 3.2 pET-15b 载体克隆、表达区3.1.2 主要试剂 1）DNA Marker VI：北京天为时代科技有限公司2）预染蛋白质 Marker：北京天根生化科技有限公司3）细菌 LB 培养基（胰蛋白胨、酵母提取物）：Promega 公司4）琼脂糖（Agarose）：上海生工生物技术有限公司5）琼脂粉（Agar powder）：上海化学试剂公司6）脱氧胆酸钠：上海亚培生物科技有限公司7）丙烯酰胺、双丙烯酰胺、四甲基二乙胺（TEMED）、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇（DTT）、异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、Tris 碱、甘氨酸、溴酚蓝：4Amr
7、esco USA8）考马斯亮蓝（Brilliant Blue R-250）：上海绿岛科技发展有限公司分装9）ECL 底物化学发光试剂盒：Pierce Biotechnology USA10）质粒小提试剂盒：北京天为时代科技有限公司11）硝酸纤维素膜（NC 膜）：浙江省台州市四甲生化厂12）一抗（Anti-his antibody，小鼠单克隆抗体 IgG2b）：北京天根生化科技有限公司13）二抗（Goat anti-Mouse IgG，(H+L)，Perpxidase Conjugated）：Pierce Biotechnology USA14）脱脂奶粉：完达山乳业股份有限公司15）其他生化试剂
8、如溴化乙锭（EB）、冰醋酸、甲醇、过硫酸铵、无水乙醇、NaCl、CaCl2、MgCl2、氨苄青霉素、氯霉素等，均为进口或国产试剂3.1.3 实验仪器 1）自动双重纯水蒸馏器 SZ-93：上海亚荣生化仪器厂2）超纯水设备 Elix3+Mil-GB：法国 Millipore 公司3）电子分析天平 AA-250：Denver Instrument Company4）恒温磁力搅拌器 78HW-1：杭州仪表电机厂5）电热恒温干燥箱 PH030：上海市实验仪器厂有限公司56）数控超声波清洗器 KQ-500DE 型：昆山市超声仪器有限公司7）全自动高压灭菌锅 HV-50：日本 HIRAYAMA8）塑料薄膜封
9、口机 SG-200 型：上海凯明电子机械有限公司9）紫外线消毒灯 ZSZ：北京海淀空后高温复合材料厂10）生物型洁净工作台 BCM-1000A：苏净集团安泰公司11）微量移液器 Research 单道/多道：Eppendorf12）恒温培养箱 HH.B11.420-BS：上海安亭13）大型摇床 QYC-211：上海福马实验设备有限公司14）空气浴震荡器 HZQ-C：哈尔滨市东明医疗器械厂15）离心机（台式低速）TDL-40B：上海安亭科学仪器厂16）离心机 Sigma1-15（台式高速）和 Sigma3K18（台式高速冷冻）：Sigma17）离心机（超微型）E-Centrifuge：Wealt
10、ec 公司18）微量振荡器 ZW-A：江苏常州国华电器有限公司19）石英定时器 SDD-2 型：北京市长风仪器仪表公司20）电子恒温水浴锅 DK-98-1：天津市泰斯特有限公司621）精密 DRY BLOCK 加热器 HGT24：TD22）酸度计 420A：Thermo Orion23）核酸电泳仪 EPS-301：Amersham Biosciences24）电泳槽 DYCP-31D：北京六一25）紫外可见光分光光度计 Ultrospec 3300：Amersham Biosciences26）凝胶成像系统 Dolphin-Doc：Wealtec 公司27）台式电脑：联想28）扫描仪 Scan
11、Maker 5900：中晶科技29）冷冻干燥系统 Lyph-Lock 12 Liter：Laboconco 公司30）普通冰箱 NR-B22S1：无锡松下冷机有限公司31）低温冰箱 925 型：Forma Scientific32）STD3101-1 蛋白电泳仪：Amersham Biosciences33）Hoefer MiniVE Vertical Electrophoresis System：Amershem Biosciences USA3.2 实验方法3.2.1 从大肠杆菌 Top10 中提取质粒 pET15b 与 pET-15b-fimA 从-70 冰箱中取出携带有 pET-15b
12、 和 pET-15b-fimA 的大肠杆菌 TOP10 菌7珠，将细菌分别划线涂布于含 Amp（100 g/ml）的 LB 固体培养基平板上，倒置平板，37培养 1216 h 后出现菌落。从培养平板中挑选氨苄青霉素抗性菌落，分别接种入 5m1 LB 培养基中(含Amp l00 g/m1)，37 振荡培养 16 h，质粒小提试剂盒分别提取质粒 DNA。步骤如下：1）4，12000 r/min 离心 OD 值超过 0.6 的菌液 2ml，弃掉上清，倒扣在滤纸上流尽残余的上清。2）加 250 l 溶液 P1，充分振荡混匀至彻底悬浮。3）加 250 l 溶液 P2，温和的上下翻转 68 次使菌体充分裂
13、解。此时菌液变得清亮粘稠，所用时间不应超过 5 min。4）加 350 l 溶液 P3，温和的上下翻转 68 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，4，12000 r/min 离心 10 min，收集离心后得到的上清。5）将上一步所得的上清加入吸附柱 CB3 中（吸附柱放入收集管中），12000 r/min 离心 30 s，弃去收集管中的废液。6）加 500 l 去蛋白液 PD，12000 r/min 离心 30 s，弃掉废液。7）加 700 l 漂洗液 PW（已加入无水乙醇），12000 r/min 离心 30 s，弃掉废液。8）加 500 l 漂洗液 PW，12000 r/min 离心 3
14、0 s，弃掉废液。9）将吸附柱 CB3 放回收集管中，12000 r/min 离心 2 min，尽量除去漂洗液。10）取出吸附柱 CB3，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 100 8l 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 6570水浴预热），室温放置 15 min，12000 r/min 离心 1 min。将 1.5 ml 离心管（DNA 溶液）于70保存。取 5 l 质粒 DNA，10 g/L TBE 琼脂糖凝胶 80 V、40 mA 电泳检测DNA。设立 marker 对照。待溴酚蓝迁移至理想位置后，终止电泳，在紫外灯下观察拍照。3.2.2 E.coli BL21(DE3)pL
15、ysS 感受态细胞的制备 采用低温 CaCl2 制备感受态细胞的方法制备大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞。步骤如下：1）从 37培养 1620 h 的平板上挑取一个单菌落（直径 23 mm），转到一个含有 50 ml LB 液体培养基的 250 ml 锥形瓶中，37，220 r/min 振摇培养 3 4 h，至 A600 大约为 0.6。2）将细菌转移到一个高压灭菌、用冰预冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放置 10 min，使培养物冷却至 0。3）4，4100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。4）倒出培养液，将管倒置 1 min 使最后的痕量培养液
16、流尽。5）用 30 ml 预冷的 0.1 mol/L CaCl2-MgCl2 溶液（80 mmol/L MgCl2 ,20 mmol/L CaCl2）重悬细胞沉淀。6）4，4100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。7）倒出培养液，将管倒置 1 min 使最后的痕量培养液流尽。8）用 2 ml 冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液重悬细胞沉淀。99）加入高压灭菌后的 50%甘油，配成含甘油 2025%的悬液，分装 100 l/支于 eppendorf 管中，70冻存。3.2.3 空质粒和重组质粒转化 E.coli BL21(DE3)pLysS 感受态细胞 1）制备含 Amp（50 g/m1）的 15 g/L 琼脂LB 固体培养基平板。2）取冻存于70的 E.coli BL21(DE3)pLysS 感受态细胞在流水下快速解冻（不可震动）。3）将提取的空质粒和重组质粒各 10 l 分别加入两支感受态细胞中，轻轻吹打混匀。4）冰浴 30 min 后，置预热后的精密水浴锅 42热休克
