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1、耐盐及苯乙酸、甲基对硫磷降解基因工程菌的构建耐盐及苯乙酸、甲基对硫磷降解基因工程菌的构建意义：意义： 地球上的水，尽管数量巨大，而能直接被人们生产和生活利用的，却少得可怜。 地球的淡水资源仅占其总水量的 2.5%，而在这极少的淡水资源中，又有 70%以上被冻结在南 极和北极的冰盖中，人类真正能够利用的淡水资源是江河湖泊和地下水中的一部分，约占地球 总水量的 0.26%。长期以来，人们并不把治理污水放在心上，而放任污水横流，甚至把大江小 河当作城市“清洁器”，只望一江春水向东流，带走垃圾和废物。全世界目前每年排放污水约为 4260 亿吨，造成 55000 亿立方米的水体受到污染，约占全球径流量的
2、 14以上。可见，治理 污水问题迫在眉睫。其中含盐废水对我们生活的影响很大。含盐废水是指含有高浓度溶解性无机盐的废水，包 括生活废水和含盐工业废水，主要 来源有海水应用于工农业生产和生活所带来的含盐废水，以及一些工业行业特别是化 工行业排放大量的含盐量极高的含盐工业废水，例如，苯乙酸生产污水中含盐量可达20%24%，农药杀虫双生产污水（蒸胺段）含盐量可达6%14%。上述废水中一般还含有大量的难降解或有毒有机物，包括顽抗性化合物，如纤维素、石油、多聚 物等，和生物异源性物质，如苯环类物质、农药（杀虫剂、除草剂）、卤代芳烃， 多环芳烃等。这些物质有很多是致癌和致畸物质，且在环境中持久性长，如不经处
3、理就排 放到环境中，将直接危害到陆生和水生生态系统，通过生物链的富集作用，积累在生物体 中，威胁人类健康。 生物处理是消除工业废水中有机污染物的最主要和最有效的方法之一，采用基因工 程的方法，将具有抗性的菌株和具有降解性状的菌株进行遗传重组，人为创造出既耐各种 逆境，又能高效降解有机污染物的基因工程菌，是解决这类废水的一种行之有效的方 法。耐盐及苯乙酸、甲基对硫磷降解基因工程菌的构建方法：1 材料和方法 1.1 菌株和质粒 菌株DLL-1为一株能完全矿化甲基对硫磷的恶臭假单胞菌 ，菌株DLL-E4是DLL-1的突变菌株，降解MP能力提高。菌株H1 是一株能耐高盐和降解苯乙酸的盐单胞菌.Esch
4、erichia coli WD803(pRK2013)具有染色体编码 的链霉素抗性和质粒编码的卡那霉素抗性，是一株辅助转移菌株. 1.2菌株抗生素抗性试验 将0.1mL过夜培养好的菌液加到融化的LB固体培养基中，倒平板，待平板凝固后， 点接抗生素纸片，培养过夜，观察有无抑菌圈出现。以大肠杆菌DH5为阴性对照。 1.3 耐盐性能测定 在葡萄糖铵盐培养基中，添加一定浓度的NaCl，接种菌株，采用比浊法测定菌体 生长情况。 1.4降解性能测定 在基础盐培养基中添加一定浓度的底物（苯乙酸），定时取样，10000r/min，离心 10min，取上清紫外扫描（UV2401），考察苯乙酸吸收峰（260nm）
5、变化情况。 1.5广宿主载体的构建HindIII酶切质粒pDT3和载体PBBR-MCS2，分别回收完整的mpd片段以及线形载体 pBBR-MCS2，对后者进行脱磷处理后，酶连构建质粒pBBR-MP; EcoRI酶切载体pKT230, 回收线形载体，并补平、脱磷，同样对获得的mpd片段进行补平和脱磷处理，酶连构建质 粒pKT-MP。构建好的质粒转化入大肠杆菌DH5中，Km抗性筛选，结合MP水解和质粒 大小进行验证。 1.6三亲杂交 受体菌、供体菌及辅助转移菌分别于3mL含相应抗生素的LB 培养基中培养过夜，按 1:2:1的比例混合后离心，用生理盐水洗涤菌体沉淀，重悬于100uL生理盐水，将菌悬液
6、 全部涂到铺在B0 平板的无菌滤膜上，培养12h，刮取菌体作适当稀释后，涂布相应选择性 平板，培养后挑取接合子，验证性状。 1.7 工程菌降解性能稳定性测定 将工程菌分别在抗性平板和LB平板上传代，验证每一代的性能，并将保存在抗性平 板上的传代菌种（传代0次、第10次、第20次和第30次）.工艺流程：工艺流程：质粒pDT3 载体pBBR-MCS2 载体pkT230 质粒pDT3Hind酶切割 Hind酶切割 EcoRI酶切割 Hind酶切割mpd片段 线性载体pBBR-MCS2 线性载体pkT230 mpd片段 脱磷处理 补平、脱磷 补平、脱磷质粒pBBR-MP 质粒pkT-MP三亲杂交 大肠杆菌DH5 pBBR-MP PKT-MP辅助质粒PRK2013 辅助质粒PRK2013H1工程菌
