《基因定性检测方法及其标准化_李俊沈旻伟武玉花吴刚》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因定性检测方法及其标准化_李俊沈旻伟武玉花吴刚（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、研究报告生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN2013年第12期随着转基因植物种植面积的增长，全球公众对于转基因植物及其产品的安全性倍加关注，为加强转基因生物的安全监管，保护消费者的知情权，全球已有 50 多个国家颁布实施了转基因生物标识制度1。为确保转基因生物标识制度的顺利实施，转基因生物及其产品检测方法的研究和标准化十分重要。在转基因产品检测过程中，PCR 技术因其灵敏度高、重现性好等特性，应用最为广泛2。以 PCR技术为基础的转基因检测，根据其检测特异性的高低分为筛选、基因特异性、构建特异性和转化体特收稿日期 ： 2013-07-04 基金项目 ： 国家自然科学基金项
2、目（31271810） ，国家转基因生物新品种培育重大专项（2013ZX08012-003） 作者简介 ： 李俊，女，硕士，研究实习员，研究方向 ： 基因工程与转基因检测 ； E-mail ： 通讯作者 ： 吴刚，男，博士，副研究员，研究方向 ： 基因工程与转基因检测 ； E-mail ： Barnase 基因定性 PCR 检测方法及其标准化李俊 沈旻伟 武玉花 吴刚（中国农业科学研究院油料作物研究所 农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，武汉 430062）摘 要 ： Barnase 基因编码核糖核酸酶，在基因工程育种中通常被用于创建雄性不育系。为了满足转 barnase 基因作物安全
3、监管的需要，建立了 barnase 基因普通 PCR、实时荧光 PCR 检测方法，具有良好的扩增特异性和检测灵敏度。barnase 基因定性PCR 检测方法经过了国内 8 家有资质的实验室的循环验证，结果表明该方法能够特异性检测样品中 barnase 基因，检测灵敏度均达到 0.10% 以上，且检测结果具有良好的重复性和重现性。符合标准方法检测特异性强、灵敏度高、重复性好的要求，为我国转barnase 基因作物检测和转基因生物安全管理制度的实施提供了相应的技术支撑。关键词 ： 转基因检测 Barnase 基因 普通 PCR 实时荧光 PCR 循环验证Development and Standa
4、rdization of Qualitative PCR Detection Method Targeting barnase Gene Li Jun Shen Minwei Wu Yuhua Wu Gang（Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430062）Abstract: Barnase gene, encoding a ribonuclease, is usually used for developing male sterility line in geneti
5、c engineering research. In order to meet the requirements of safety regulation of transgenic crops, the conventional PCR and real-time PCR detection methods targeting the barnase gene were developed, displaying exollent amplification specificity and test sensitivity. The qualitative methods targetin
6、g barnase gene were validated by 8 certified laboratories, results showed that this method could specifically detect the barnase gene from testing samples with satisfactory detection sensitivity of about 0.1%, fine repeatability and reproducibility, meeting the performance criteria of standard metho
7、ds. This study established a suitable method for detection of the transgenic crops harboring the barnase gene, providing technical support for the safety management of transgenic crops in China.Key words: GMO detection Barnase gene Conventional PCR Real-time PCR Validation异性检测 4 个层次3，4。其中转化体特异性检测方法特
8、异性最高5，目前我国已经针对批准进口和在国内取得安全证书的转基因品种建立了完善的转化体特异性检测标准体系。但在检测工作中，只采用转化体特异性检测方法进行检测非常耗时耗力。为了提高检测效率，通常先采用筛选或基因特异性检测方法对样品进行初步的筛查检测，然后有针对性的采用转化体特异性检测方法对样品进行身份鉴定。因此，以转基因品种中的目的基因为检测靶标建立基因特异性检测标准，不仅会提高检测工作的效率，生物技术通报 Biotechnology Bulletin2013年第12期130而且会进一步完善我国现行的标准体系。Barnase 基因来源于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefac
9、iens） ，编码区长 330 bp，编码一种含110 个氨基酸残基的核糖核酸酶6。这种小分子的 RNA 酶，在细胞中表达可以非特异性降解胞内RNA，产生强烈的细胞毒性，其在特异细胞中的表达通常都会导致宿主细胞死亡7。Barnase 基因这一特性，已经在控制肿瘤细胞的再生以及病毒复制等领域得到应用8。在植物研究领域，barnase 基因最为重要和最为成功的应用还是通过其在花粉绒毡层中的特异表达导致花粉败育，进而培育出转基因植物雄性不育系9。自从 Mariani 等10，11首次获得烟草和甘蓝型油菜雄性不育系植株之后，barnase 基因在转基因育种中获得广泛应用，陆续有育种家将该基因转化到不同
10、植物中并成功获得转基因雄性不育性植株，如棉花12、白菜13、花椰菜和菊苣14等。现在， 通过组合使用转化 barnase 基因的雄性不育系、转 barstar 基因的育性恢复系和非转基因受体育性保持系，已经成功实现了三系配套的杂交育种15，16。例如，拜耳公司（Aventis CropScience）将 barnase基因转化到油菜中，培育出了雄性不育转基因油菜MS1、MS8、Phy14、Phy23、Phy35 和 Phy36， 并 利用雄性不育系 MS1 和 MS8 培育出耐除草剂甘蓝型油菜杂交种 MS1RF1、MS1RF2 和 MS8RF3 ；另外，将 barnase 基因转化到玉米中，培
11、育出玉米雄性不育品系 MS3 和 MS617；荷兰 Bejo 种子有限公司（Bejo Zaden BV）将 barnase 基因导入到菊苣（Cichorium intybus Chicory）中培育出了菊苣雄性不育系 RM3-3、 RM3-4、RM3-618。目前，含有barnase 基因的转基因作物已经在多个国家被批准商业化种植和销售，如商业化的转基因杂交油菜品种MS1RF1、MS1RF2 和 MS8RF39。国内的一些研发者将 barnase 基因转化到黑杨、西瓜、玉米、水稻及甘蓝等植物中，获得了育性改变的转基因植物19-24。Barnase 基因在三系配套育种中应用潜力巨大，研制标准化的
12、 barnase 基因检测方法，可有效监管转 barnase 基因的转基因作物。潘良文等25，26为检测抗草丁膦油菜籽，初步研究了 barnase 基因的检测方法，但未考察该方法的扩增特异性及检测灵敏度等参数。迄今为止，国内外尚未建立 barnase 基因标准化的检测方法。本研究将以 barnase 基因作为检测靶标，建立特异性强、灵敏度高、重复性好的 barnase 基因定性 PCR 检测方法，并使其标准化，为监管转 barnase 基因作物服务。1 材料与方法1.1 材料 转基因材料种子粉末均由农业部科技发展中 心 提 供， 包 括 转 基 因 油 菜 MS1、MS8、RT73、RF1、R
13、F3、OXY235、Topas19/2 和 T45 ；转 基 因棉花 Mon531、Mon1445 和 Mon88913 ；转基因玉米Mon88077，Bt176、Mon863 和 GA21 ；转基因大豆Mon89788、A2704-12 和 GTS-40-3-2 ； 转基因水稻科丰 6 号和 TT51-1。非转基因玉米苏玉糯 1 号，非转基因油菜中油 821，非转基因棉花中棉 35，非转基因大豆中豆 29，非转基因水稻明恢 63 均由本实验室保存。1.2 方法1.2.1 植物基因组 DNA 提取 用 QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit（No.69104，Qiagen，G
14、ermany） 试 剂盒提取种子粉末基因组 DNA，具体操作步骤详见说明书。提取的 DNA 用超微量分光光度计 NanoDrop 2000（Thermo，USA）检测纯度和浓度。1.2.2 PCR 反应体系及反应条件 普通 PCR ： 根据barnase 基因的核苷酸序列，用 Primer Premier 5.0 设计正向、反向普通 PCR 引物各 5 条（表 1） ，并委托上海生工生物技术公司合成。以转基因油菜 MS8 质量百分含量为 0.5% 的油菜基因组 DNA 为模板，将表 1 中的正向引物和反向引物进行两两组合，进行PCR 扩增，每个反应设置 2 个重复，筛选扩增条带最亮、 重现性最
15、好的引物组合。普通 PCR 反应体系：50 ng 基 因 组 DNA 1.0 L，10PCR buffer 2.5 L，25.0 mmol/L MgCl2 1.8 L，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 L，10 mol/L primer 0.5 L，1 U/L Taq DNA 聚合酶 0.5 L，加 ddH2O 至总反应体积为 25 L。普通 PCR 反应条件为 94变性 5 min ； 94变性 30 s，58退火30 s，72延伸 30 s，共进行 35 次循环 ； 72延伸7 min。用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，根据电泳结果筛选出最佳扩增引物组合。设置不同的 Mg2+浓度
16、、退火温度梯度优化反应体系，确定普通 PCR 最2013年第12期131李俊等 ： Barnase 基因定性 PCR 检测方法及其标准化佳反应体系和反应条件。PCR 反应体系中，Mg2+浓度尤为重要，直接影响引物的扩增特异性，以及酶的催化能力的准确性27。 本研究设置1.5、 1.6、 1.8、 2.0 mmol/L 4 个 Mg2+浓度梯度进行 PCR 分析。在 PCR反应条件中以退火温度（Tm）最为重要，在 Tm 值允许的范围内，适当提高反应的退火温度可使 PCR产物的特异性增强27。根据引物设计时设置的 Tm值范围，共设计了 52、54、56、58、60 5 个退火温度，进行 PCR 分析。实时荧光 PCR ：用 Beacon Designer 2.0 设计实时荧光 PCR 引物和探针序列（表 1） ，并委托上海生工生物技术公司合成。实时荧光 PCR
