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1、工程菌株选育工程菌株选育 2011-11-26 08:41 | (分类:默认分类)第一章 绪论第一节 工业微生物育种在发酵工业中的地位第二节 工业微生物育种的进展工业微生物育种是建立在遗传和变异的基础上的，没有变异，生物界将失去进化的素材； 没有遗传，变异也无法积累。通过菌种的选育我们可以提高产品的产量和质量。一、工业微生物育种技术的发展经历了几个阶段（一）自然选育：对工业微生物育种有很大的影响。例如1、在酒精发酵中，推广了自然选育的纯系良种，扭转了酒精生产中的不稳定现象。 2、由于自然突变频率低，单纯依赖自然界存在的微生物群体来进行的自然选育无疑有很大 的局限性，进而推进了人工诱变育种的发展
2、。（二）诱变育种1、发酵工业中的各种优良高产菌株绝大部分都是诱变育种方法获得的菌株。2、但是，菌株长期使用诱变剂处理后，会产生诱变剂疲劳效应，所以出现了杂交育种。 （三）杂交育种 1、杂交育种也应当建立在诱变育种的基础上。2、杂交育种的主要目的在于把不同菌株的优良经济性状集中于重组体中，克服长期用诱变 剂处理造成的上述缺陷，同时杂交还是增加产品新品种的手段之一。（四）代谢控制育种1、是以 20 世纪 50 年代谷氨酸发酵取得成功为起点的 2、代谢控制育种的活力在于以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过了微生物正常代谢途 径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量生成和积累。 （五）基因工程育种
3、第二章 工业微生物育种诱变剂诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物 质，称为诱变剂。它们包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂三大类。第一节 物理诱变剂物理诱变剂是通常使用物理辐射中的各种射线，较广泛的是紫外线、X 射线、 射线和快 中子。物理辐射分为电离辐射和非电离辐射，都是以量子为单位的可以发射能量的射线。 电离辐射在穿过物质时能产生离子，非电离辐射在穿过物质时不能产生离子。电离辐射（X 射线、 射线），非电离辐射（紫外线） 一、物理诱变剂的生物学效应1、物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变 异的一些列复杂的连
4、锁反应过程。 2、其作用通常分为物理，物理-化学，化学和生物学等几个阶段。 3、辐射引起的生物效应，根据辐射种类和微生物种类不同而有所差异，电离辐射主要引起 DNA 上的基因突变和染色体的畸变；非离辐射主要导致形成嘧啶二聚体。 二、非电离辐射紫外线 （一）紫外线1、紫外线的有效光谱：紫外线的光谱范围在 40390nm，DNA 可以吸收的紫外线光谱为 260nm。15W 紫外灯管放射出来的紫外线大约有 80%的波长集中在这个范围内，诱变效应 比 30W 的好。 2、紫外线的辐射剂量：紫外线的诱变剂量可分绝对剂量和相对剂量 三、电离辐射电离辐射的照射方法直接对平皿上生长的菌落进行照射，或者用直径
5、6-10mm 的打孔器把菌落连琼脂一 同取出，置于灭菌平皿内进行照射，也可制成菌悬液。（取 1ml 置于试管内并浸入冰水 中，从上或侧面或向下进行短时间照射，处理完后把装有菌体细胞的试管继续冰裕 2-3 h， 因为低温可以降低或抑制修复酶的活性，防止突变体因修复酶的修复而还原为正常细胞 第二节 化学诱变剂化学诱变剂是一类能对 DNA 起作用、改变其结构、并引起遗传变异的化学物质。 化学诱变剂种类很多，有无机化合物和有机化合物，本节介绍的化学诱变剂包括四大类： 碱基类似物、烷化剂、移码突变剂和其他种类。一、碱基类似物碱基类似物是一类和天然的嘧啶嘌呤等四种碱基分子结构相似的物质，是一种既能诱发正
6、突变，也能诱发回复突变的诱变剂。1、碱基类似物的诱变处理方法（以 5-BU 和 5-FU 为例） 单独处理：将新鲜斜面的细菌移接到前培养的液体培养基中，培养到对数期，离心 除去培养液，加入生理盐水或缓冲液，饥饿培养 8-10h，以消耗其体内的储存物质。将 5-BU 或 5-FU 加入到以上饥饿培养的培养液中，使终浓度为 25-40g/ml，混合均匀。取0.1-0.2 ml 菌悬液加入到琼脂平板上涂布培养，使之在适宜温度下的生长过程中诱变处理。 培养后挑取单菌落进行筛选。如果处理真菌、放线菌孢子，则要提高 5-FU 的浓度。 与辐射线复合处理：菌体先用碱基类似物处理，将它们渗入到 DNA 分子中
7、，然后用辐 射线照射，诱变后的效果比单独更好。 二、烷化剂烷化剂分单功能烷化剂和双功能烷化剂或多功能烷化剂两大类。前者仅一个烷化集团， 对生物毒性小，诱变效应大；后者具有两个或多个烷化集团，毒性大，致死率高，诱变 效应较差。 （一）烷化剂的性质烷化剂性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解，大部分半衰期很短，其 长短与温度、溶液 pH 关系很大。1、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（简称亚硝基胍） 符号 NTG 或 NG 或 MNNG NTG 有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合诱变营 养缺陷型突变株；还可使多基因并发突变。 处理完毕后，马上把接触过的 NTG
8、 的器皿用 NaOH 或 Na2S2O3 浸泡处理。NTG 的诱变方法： 1）孢子悬液的制备；2）NTG 母液制备；3）混合； 4）终止反应，除去药液，得孢子用无菌水稀释后涂皿。 2、甲基磺酸乙酯（简称 EMS） 三、脱氨剂（以亚硝酸为例）（一）诱变机制亚硝酸可直接作用于正在复制和未复制的 DNA 分子，脱去碱基中的氨基变成酮基，改变 碱基氢键的电位。 （二）处理方法四、移码诱变剂（一）诱变机制与 DNA 相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。主要包括吖啶黄、吖啶橙、原黄素等 化合物。 （二）吖啶黄的性质和使用方法是淡黄色晶体，微溶于热水，溶于乙醇和乙醚，不稳定，遇光易分解，须避光保存。五、羟
9、化剂（以羟胺为例）羟胺简称 HA，常以盐酸羟胺形式存在，为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性， 容易吸湿，要密封、干燥保存。 六、金属盐类用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等，氯化锂比较常用。单独使用没有明显的诱变效果，常与其它诱变配合处理，称为助诱变剂。第三章 工业微生物产生菌的分离筛选菌株分离的定义：是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要 求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生 物的过程。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离和鉴定几个步骤。第一节 含微生物样品的采集一、从土壤中采样土壤由于具备了微生物所需的
10、营养、空气和水分，是微生物最集中的地方，所以土壤样品 往往是首选的采集目标。二、根据微生物生理特点采样（一）根据微生物的营养类型例如：森林土：有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，还有丰富的纤维素，适合利用纤维 素作为碳源的纤维素酶产生菌生长；肉类加工厂和饭店排水沟：有大量腐肉、豆类、脂 肪类存在，能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌；面粉厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂： 容易分离到淀粉酶和糖化酶的菌株果蔬中：分离果胶酶产生菌。（二）根据微生物的生理特性如筛选高温酶产生菌时，通常要到温度较高的南方、或温泉、火山爆发处及北方的堆肥 中采集样品；分离低温酶产生菌时到寒冷的地方，如南北极地区，冰窖、深海中采集样
11、品。第二节 含微生物样品的富集培养富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基， 创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来 自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离到所需要的菌株。第三节 好氧微生物的分离一、稀释涂布和划线分离法1、稀释涂布分离法： 土壤样品以十倍级差稀释，涂平板，待长出单个菌落后，挑取需要的菌落一道斜面培养 基上培养。土壤样品的稀释程度，要看样品中的菌含量多少来进行稀释。2、划线分离法 用接种环取部分样品，在培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养 基上，培养备用。二、利用平皿中生
12、化反应进行分离（一）透明圈法1、原理：在平板培养基中，加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物 便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。 2、应用：在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶等。 （二）变色圈法1、原理：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂， 使所需微生物能快速鉴别出来。2、如筛选果胶酶产生菌时，用含 0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进 行分离，待菌落长成后，加入 0.2%刚果红溶液染色 4h，具有分解果胶能力的菌落周围便 会出现绛红色水解圈。 3、在分离产生脂肪酶的菌株
13、时，如以土温为底物，尼罗兰作为指示剂，根据变色圈的大小 来判断脂肪酶的活性高低。也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明 B 为指示剂，以荧光圈来 测定。 （三）生长圈法1、适用范围：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。 2、原理：工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检测菌涂布于含高浓度的工具菌并 缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落 周围便会形成一个混浊的生长圈。 （四）抑菌圈法1、应用：常用于抗生素产生菌的分离筛选。 2、采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，还能筛选某些酶类。第四节 厌氧微生物的分离一、厌氧培养中几种除氧方法1、加还原剂
14、：分离培养基内加入还原剂，操作时以最快的速度划线分离，然后立即置于事 先已抽真空密闭的容器内（充 CO2 或 N2 也可），于适温培养。2、焦性没食子酸法：焦性没食子酸和 NaOH 反应除去氧气。操作时将焦性没食子酸放在 容器中，把含有厌氧菌样品的培养皿架空放入容器内，然后加入 NaOH 溶液，立即盖上盖 子，并用石蜡或凡士林密封，放到室温下培养。要除去 100Ml 空气中的氧气需要焦性没食 子酸 1g 和 10%NaOH 溶液 10ml。 3、平皿厌气培养法：将无菌培养皿皿盖内倒上分离培养基，凝固后，皿底一侧放焦性没食 子酸固体，另一侧放 10%的 NaOH 溶液，使二者不接触，准备完毕后，
15、在凝固的琼脂平板 上迅速把含厌氧菌样品进行划线，然后盖上皿盖并密封，摇动平皿使焦性没食子酸固体和 NaOH 溶液混合，发生化学反应，除去皿内的氧气，置室温下培养。 二、红螺菌的分离1、富集培养：取暴露在日光下富含有机物的淤泥。放适量淤泥于 50ml 的带玻璃塞的磨口 瓶中，加满液体培养基，塞好塞子，隔绝空气。置于 30的照明箱中培养，通常在 3d 内 可看到深处培养基里和淤泥曝光的一侧呈现微红色的生长物。从微红色处取数毫升的富集 培养物，接种于第二瓶的富集培养基中，培养 2d。 2、分离培养：培养基成份和配置；接种：取富集培养物于分离平板上划线或涂布分离， 或用摇管法于柱状培养基中分离。三、反
16、硝化细菌的分离1、 富集培养：在富集培养液的试管中分别加少量的海泥或池泥、河泥，在 20或 25-30下培养 5-15d.若培养液变浑浊，有气泡产生，说明有反硝化细菌生长，或检验其有无 氨和亚硝酸产生，则可判定是否有反硝化细菌生长。 2、分离培养：将培养液倾入硅酸胶平板上，于 50下烘烤至表面无水流动，不宜过干， 以免破裂。用富集培养物涂布接种于烘烤后的平板培养基上，于适温、厌氧条件下培养至 长出足够大的菌落。观察菌落向台，进行革兰氏染色，油镜下观察其反应及菌体形态。挑 取菌落于液体培养基上培养，检验其培养液中有无硝酸盐和亚硝酸盐存在，若硝酸根或亚 硝酸根消失，可确定所分离细菌属反硝化细菌。第五节 野生型目的菌株的筛选和菌株鉴定一、初筛（一）平板筛选对那些在纯化分离阶段没有采用平皿定性法挑选出来的菌落，即随机挑选的菌株，由 于数量很大，又不知是否具有目的产物的生产能力，这时只能首先采取较粗放的检测方法菌种选育工作者在初筛时经常使用这种平皿快速检测法，将复杂而费时的化学测定改为 平皿上肉眼可见的显色或生化反
