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1、四个鲤鱼种群遗传多样性的四个鲤鱼种群遗传多样性的 AFLPAFLP 分析分析钟立强1，2，张成锋1，周凯1，3，李冰1，3，王建新1，朱健1，2，3（1.农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室, 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 无锡 214081; 2. 上海海洋大学水产与生命科学学院, 上海 2013063, 3. 南京农业大学无锡渔业学院, 无锡 214081）摘摘 要：要：采用 AFLP 对黑龙江野鲤、黄河鲤、建鲤和荷包红鲤 4 个鲤鱼种群共 96 个个 体进行了遗传多样性分析。结果显示，8 对选择性扩增引物共扩增得到 502 个位点，其中 多态性位点 273 个，多态性
2、为 54.38%。对 4 个种群的 Shannon 多样性指数，Neis 基因多 样性等参数进行了分析，结果表明，总基因多样性（Ht）平均值为 0.17210.0350；种群 内基因多样性（Hs）平均值为 0.12240.0190。基因分化系数（Gst ）为 0.2892，种群内 的基因多样性占总群体的 71.08%，种群间为 28.92%，而基因流系数（Nm）为 1.2291。分 子方差分析（AMOVA）表明，种群平均近交系数（Fst）为 0.31191，变异 31.19%来自种 群间，68.81%来自种群内。四个种群中黑龙江野鲤的种内多态性比例最高，而荷包红鲤种 群最低。四个鲤鱼种群当前的
3、种质资源良好，具有一定的种群稳定性。建鲤已经开始分化， 与亲本荷包红鲤亲缘关系逐渐边缘，逐步形成自己稳定的遗传结构。关键词：关键词：鲤鱼；种群；AFLP；遗传多样性Analysis of genetic diversity of common carp by AFLP markersZHONG Li-qiang 1,2，ZHANG Cheng-feng 1，ZHOU Kai 1,3，LI Bing 1,3，WANG Jian-xin 1，ZHU Jian1,2,3(1. Key laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of
4、Freshwater Fishes, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Science, Wuxi 214081, China; 2.Fisheries and Life science College, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Fisheries College, Nanjing Agriculture University, Wuxi 214081, China)
5、Abstract: The genetic diversities of ninety-six individuals from four populations of Hei Longjiang carp (HLJ), Huanghe carp (HH), Jian carp (JL) and Hebao red carp (HB) were analyzed by AFLP markers. In total, 273 polymorphic loci of 502 were amplified by 8 primer pairs and the percentage of polymor
6、phic loci was 54.38%. The Shannon information indices of the HLJ, HH, JL and HB populations were 0.21140.2705, 0.18250.2694, 0.18880.2587 and 0.16000.2426, respectively. And the Neis gene diversity index was 0.1398 0.1872, 0.1225 0.1863, 0.12350.1774 and 0.10360.1636, respectively. The average total
7、 genetic diversity (Ht) was 0.17210.0350 and the average genetic diversity within populations (Hs) was0.12240.0190. Among the four populations the gene differentiation coefficient (Gst ) was 0.2892. The genetic diversity was 71.08% within populations and 28.92% among the populations. The gene flow i
8、ndex 基金项目基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项基金（中国水产科学研究院淡水渔业研究中心） （2009JBFB14）; 现代农业产业技术体系建设专项资金资助 作者简介作者简介：钟立强（1985 - ）, 男, 硕士, 主要从事水产动物遗传育种研究. Email： 通讯作者：通讯作者：朱健, 研究员. Email） (Nm) was 1.2291. The analysis of molecular variance AMOVA analysis indicated that the average fixation index (Fst ) was 0.31191. Vari
9、ance among populations was 31.19% and 68.81% within populations. The highest polymorphism ratio was showed in the HLJ group and the lowest in HB group. Current germplasm resource of four common carp populations was in good condition. Some genetic differentiations were showed between Jian carp and it
10、s parent Hebao red carp, and Jian carp was forming its own stable genetic structure. Key words: common carp; population; AFLP; genetic diversity鲤鱼(Cyprinus carpio)是我国重要的淡水养殖鱼类,其养殖历史悠久，养殖范围广阔。 在自然变异的基础上经过多年的人工选育,我国各地获得了多个具有明显杂种优势的杂交鲤鱼品种1。因此，充分认识鲤鱼的种群遗传结构和遗传多样性，对其种质资源保护、开发 和持续利用具有重要意义。 扩增片段长度多态性（ampli
11、fied fragment length polymorphism，AFLP）分子标记技术2结合了 RFLP 和 RAPD 的特点，具有多态性高、稳定性好、灵敏度高、重复性好等优点，已在水生动物的遗传多样性、种质研究与鉴定、群体间亲缘关系和系谱分析中得到了广泛应用3-12。本研究利用 AFLP 技术对黑龙江野鲤、黄河鲤、建鲤和荷包红鲤四个种群的遗 传多样性进行分析，以期进一步了解鲤鱼种群的遗传特性和遗传分化，为其种质资源的保 护和合理利用提供科学依据。1 材料与方法材料与方法1.1 材料材料 四个鲤鱼种群样品分别采集于黑龙江、河南武陟县黄河鲤原种场、中国水产科学研究 院淡水渔业研究中心宜兴养殖
12、场和江西婺源，每个种群采样 30 尾，剪取活鱼尾鳍，与 95%乙 醇中固定和保存。 1.2 总总DNA的提取的提取基因组 DNA 的提取参照 Sambrook 等分子克隆实验指南13。DNA 浓度、质量用 分光光度仪（Unico UV-4802H）和 1%琼脂糖凝胶电泳检。总 DNA 稀释至 100ng/L，20储存备用。 1.3 AFLP图谱的构建图谱的构建参照 Vos 2等和 Wang 14等的方法构建 AFLP 图谱,实验用限制性内切酶 EcoR I 和 Mse I 均购自 NEB 公司，所有引物均由上海生工合成。 1.3.1 酶切反应酶切反应 采用 EcoR I/Mse I 双酶切组合
13、反应体系 10 L，其中 DNA 模板 1 L (100 ng)，Mse I 0.5 L (1 500 U)，EcoR I 0.25 L(5 000 U)，10Buffer Tango 2 L，用 ddH2O 补齐体积。反 应体系 37 酶切 4 h，然后 75 15min 使内切酶失活。将离心管置于冰上，降温后稍离 心，收集酶切产物。 1.3.2 连接反应连接反应 酶切产物与EcoR I/Mse I 接头相连接（表 1）， 连接反应体系为20 L( 冰上操作)， 其中酶切产物10 L，EcoR I 接头5 pmol，Mse I 接头50 pmol，T4 DNA 连接酶0.5 L 和10buf
14、fer 2 L，用ddH2O补齐体积。16 保温连接过夜。 1.3.2 预扩增反应预扩增反应 连接产物的预扩增引物：EcoR I：5GACTGCGTACCAATTC3，Mse I：5 GATGAGTCCTGAGTAA 3。PCR 扩增反应体系：模板为 0.5 L 连接产物，引物各 0.5 L，10 L 2PCR Mix，无菌超纯水补足 20 L 。预扩增 PCR 反应程序为：94 2 min；然后 94 30 s，56 30 s，72 2 min，25 个循环；最后 72 延伸 10min。预扩 增产物经 1 琼脂糖凝胶电泳检测后，稀释 50 倍。 1.3.3 选择性扩增反应选择性扩增反应 经
15、过初筛，从 64 对 AFLP 选择性扩增引物中选择了清晰和多态性高的8 对引物组合 进行扩增。选择性扩增引物序列见表 1。选扩增反应体系为25 L，包括稀释后的预扩增产 物1 L，选择扩增引物各10 pmol，2PCR Mix 12.5L，ddH2O 补足体积。PCR 反应程序 为：94 变性2 min，再94 30 s ，65 30 s（每循环退火温度降低1 ），72 1 min 10个循环，然后94 30 s，56 30 s，72 1 min，26个循环，最后72 延伸10 min，扩增产物-20保存。表 1 AFLP 接头及引物序列 Tab.1 AFLP adapters and pr
16、imer Sequence内切酶接头序列（5- 3）选择性扩增引物序列（5- 3）EcoR IMse I CTCGTAGACTGCGTACC AATTGGTACGCAGTCTAC GACGTGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCATE1：GACTGCGTACCAATTCAA C E2：GACTGCGTACCAATTCAA G E3：GACTGCGTACCAATTCAC A E4：GACTGCGTACCAATTCACT M1：GATGAGTCCTGAGTAACA A M2：GATGAGTCCTGAGTAACA C M4：GATGAGTCCTGAGTAACA T M6：GATGAGTCCTGAGTAACT C M7：GATG
