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1、食 用 菌 学 报 Z 2010. 17 (2) : 1 6收 稿 日 期 :2009212221 原 稿 ; 2010203216 修 改 稿基 金 项 目 :上 海 市 农 业 遗 传 育 种 重 点 实 验 室 开 放 课 题 “ 香 菇 2 标 记 的 开 发 、 鉴 定 及 其 在 种 质 资 源 多 样 性 分 析中 的 应 用 ” (编 号 :的 部 分 研 究 内 容作 者 简 介 :刘 春 滟 (1983 - ) ,女 ,安 徽 农 业 大 学 在 读 硕 士 研 究 生 ,主 要 从 事 分 子 生 物 学 研 究 。3 本 文 通 讯 作 者 126. 编 号 :1005
2、29873 (2010) 0220001206香 菇 的 开 发 及 应 用刘 春 滟 1 , 李 南 羿 2 , 张 玉 琼 1 3(1 安 徽 农 业 大 学 生 命 科 学 院 ,安 徽 合 肥 230036 ; 2 浙 江 林 学 院 农 业 与 食 品 学 院 ,浙 江 临 安 311300)摘 要 : 从 N 下 载 了 12 184 条 香 菇 ( 表 达 序 列 标 签 ( ) 序列 ,处 理 后 得 到 全 长 3 681 177 4 684 个 U 在 其 中 共 发 掘 出 142 个 简 单 重 复 序 列 ( ,分 布 于 120 条 中 ,分 布 频 率 为 2.
3、99 % (平 均 分 布 距 离 :25. 924 。 其 中 ,单 、 二 、 三 核 苷 酸重 复 是 主 要 的 重 复 类 型 ,A/ T ,A G/ C T ,A C G/ C 单 、 二 、 三 核 苷 酸 的 主 要 重 复 基 序 ,分 别 占 所 有 23. 23 %、 21. 83 %和 10. 56 %。 利 用 引 物 设 计 软 件 0 设 计 了 40 对 引 物 ,并 利 用 6 %变 性 聚丙 烯 酰 胺 凝 胶 在 18 个 香 菇 品 种 中 进 行 检 测 。 其 中 ,22 对 引 物 为 多 态 性 引 物 ,多 态 率 为 55 %。 应 用 N
4、S 软件 的 聚 类 方 法 分 析 表 明 ,18 份 材 料 遗 传 相 似 系 数 范 围 为 0. 375 0. 984 ,与 前 人 研 究 结 果 相 符 。关 键 词 : 香 菇 ; 序 列 ; 标 记 ; 多 态 性 ; 遗 传 多 样 性简 单 重 复 序 列 ( 机 分 布 在 真 核 生 物 的 基 因 组 中 ,呈 孟 德 尔 式 遗传 ,共 显 性 ,具 有 数 量 丰 富 、 多 态 性 高 、 重 复 性 好 等优 点 1 。 公 共 数 据 库 中 快 速 增 长 的 表 达 序 列 标 签( 数 据 为 开 发 记 提 供 了 一 个 省 时 省 力 又 低
5、成 本 的 来 源 2 , 有 很 高 的 可 转 移 性 3 ,并 可 被 用 在 构 建 遗传 图 谱 4 及 比 较 基 因 作 图 5 等 方 面 。香 菇 (L 具 有 重 要 的 食 药 用 价值 ,其 “ 同 种 异 名 ,异 种 同 名 ” 的 现 象 较 普 遍 ,需 要 建立 快 速 准 确 稳 定 的 鉴 定 检 测 方 法 6 。 本 研 究 采 用18 个 香 菇 品 种 作 为 模 板 ,开 发 其 记 ,研 究 品 种 间 的 遗 传 差 异 ,可 进 一 步 应 用 在 食 用 菌 的菌 株 鉴 定 和 亲 缘 关 系 的 分 析 等 方 面 ,为 香 菇 种
6、质 资源 的 评 价 和 遗 传 育 种 提 供 参 考 。1 材 料 和 方 法1. 1 香 菇 品 种18 个 香 菇 品 种 分 别 为 :1. 霞 若 香 菇 (野 生 ) 由上 海 市 农 业 科 学 院 食 用 菌 研 究 所 陈 明 杰 研 究 员惠 赠 ;2. 申 香 2 号 、 3. 申 香 4 号 、 4. 5. 6. L 冬 香 、 7. 8. 9. 11. 12. 7402、 13. 9015、 14. 98411、 一 号 、 16. 闵 丰 一 号 、 17. 香 九 、 18. 庆 科 20 由上 海 市 农 业 科 学 院 食 用 菌 研 究 所 尚 晓 冬 副
7、 研 究员 惠 赠 。1. 2 香 菇 D 取采 用 提 取 香 菇 基 因 组 具 体步 骤 见 文 献 7 。1. 3 在 库 中 发 掘 2008 年 8 月 23 日 ,在 据 库 中共 搜 索 到 12 184 条 香 菇 列 ,采 用 软 件 除 去 5 或 3 端 的 ,以 及 长 度 小 于 100 列 ,对 于长 度 大 于 700 则 保 留 其 5 端 的700 再 利 用 3 软 件 9 进 行 片 段 重 叠 群 分析 和 聚 类 ,拼 接 时 设 定 的 初 始 装 配 参 数 均 为 默 认值 ,最 后 将 得 到 的 4 684 条 高 质 量 的 U 利用 软
8、 件 在 其 中 搜 索 搜 索 标 准 为 :单 、 二 、 三 、 四 、 五 、 六 核 苷 酸 的 最 少 重 复 次 数 分 别为 12、 6、 5、 5、 5、 5 次 ,同 时 也 包 括 中 间 被 一 段 序列 打 断 (不 超 过 10 不 完 全 重 复 统 计 复 基 序 出 现 的 类 型 时 ,将 每 种基 序 所 有 的 + 1 位 移 码 及 其 互 补 序 列 均 视 为 同 一个 类 型 。 如 二 核 苷 酸 重 复 基 序 A A、 归 为 同 一 个 类 型 ;单 核 苷 酸 将 分 为 A、 C 两食 用 菌 学 报 第 17 卷类 ,而 二 、 三
9、 、 四 、 五 、 六 核 苷 酸 重 复 基 序 类 型 的 数量 分 别 为 4、 10、 33、 102 和 350 种 。1. 4 设 计利 用 引 物 设 计 软 件 08 ,在含 有 设 计 引 物 。 主 要 设 定 参数 为 : 量 为 45 % 60 % ,退 火 温 度 为 5560 ,预 期 片 段 长 度 在 150 250 间 ,引 物长 度 在 18 22 间 ,并 由 上 海 赛 百 盛 公 司合 成 。1. 5 和 电 泳 检 测 应 体 系 为 : 15 L 反 应 体 系 中 含 有1. 0 N A (25 35 , 1. 5 L 10 缓 冲 液 , 0
10、. 75 L 2. 5 m L P , 0. 9 m L 0. 9 L 5 U r 合 酶 (购 于 Ta ka 司 ) , 10 L 引 物 各0. 75 L , 8. 45 L 2 O 。 反 应 条 件 为 :94 预 变 性 4 94 变 性 30 s ,退 火 45 s (除 引 物 L L 火温 度 为 54 和 53 之 外 ,其 余 为 57 ) , 72 延 伸 30 s , 35 个 循 环 ;最 后 72 延 伸 7 mi n。 产 物 采 用 6 %的 变 性 聚 丙 烯 凝 胶 电 泳检 测 其 多 态 性 。1. 6 多 态 性 统 计 分 析统 计 多 态 性 位
11、 点 ,有 带 记 为 l ,无 带 记 为 0 ,生成 距 阵 ,利 用 N . 1010 软 件 对 数 据 进 行分 析 ,以 不 加 权 成 对 算 术 平 均 法 ( U P 对 材料 进 行 聚 类 。2 结 果 与 分 析2. 1 香 菇 布 频 率 和 特 点从 得 的 12 184 条 经 过 处 理 后得 到 长 为 3 681 177 4 684 条 高 质 量 的冗 余 率 为 61. 56 % ,在 其 中 共 搜 索 到142 个 出 现 的 频 率 为 2. 99 % ,平 均 距 离 为25. 924 即 每 25. 924 一 个 点 ,分布 在 120 个
12、。 其 中 有 17 个 U 个 或 2 个 以 上 点 , 最 多 的 一 个 有 5 个 点 。 单 、 二 、 三 核 苷 酸 主 要 的 重 复 类 型 ,分 别 为 42、 39 和 59 个 ,分 别 占 总 29. 58 %、 27. 46 %、 41. 55 % ,没有 搜 索 到 四 核 苷 酸 五 、 六 核 苷 酸 一种 ,均 占 总 0. 7 %。 由 此 可 看 出 ,香 菇 现 的 种 类 较 丰 富 而 且 不 同 类 型 的 现 的 频 率 差 别 也 较 大 。图 1 香 菇 基 序 的 分 布1 SR . 1. 3 中 的 统 计 方 法 , 本 研 究 中
13、 出 现 的单 、 二 、 三 、 五 、 六 核 苷 酸 重 复 基 序 的 数 量 分 别 为2、 4、 8、 1、 1 种 (见 图 1) 。 从 各 基 序 出 现 的 次 数 上看 , A/ T , A G/ C T , A C G/ C 出 现 33、 31、 15次 ,是 出 现 次 数 最 多 的 类 型 , 分 别 占 总 的23. 23 %、 21. 83 %和 10. 56 %。2. 2 的 筛 选 及 评 价设 计 的 40 对 引 物 中 显 示 扩 增 的 有 36 对 ,占 所 设 计 引 物 的 90 % ,其 中 有 4 对 引 物 扩 增 出偏 离 目 的 产 物 的 多 个 条 带 ,22 对 能 够 扩 增 出 特异 位 点 (表 1) 并 显 示 出 多 态 性 的 引 物 (图 2) ,占可 扩 增 引 物 的 61
