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1、贵阳医学院医学生物技术专业微生物工程论文（2010 级）题 目 柠檬酸的液体深层发酵生产及应用班 级 医学生物技术专业 2010 级 学生姓名 龙妮娅 学 号 20100101008 完成日期 2013 年 12 月 8 日 - 0 -柠檬酸的液体深层发酵生产及应用龙妮娅摘要：摘要：本文通过查阅文献对目前国内生产柠檬酸的主要发酵工艺流程做简单的综述和总结，应用黑曲霉柠檬酸产生菌，采用深层液体发酵法，从菌种的选育、发酵底物的选取、培养条件的选择以及产物分离提取的方法，介绍了柠檬酸的发酵生产流程，另外对于柠檬酸的应用前景和未来的发展趋势做一个简单的概述。关键词：关键词：柠檬酸 黑曲霉 深层发酵 工
2、艺流程 引言引言柠檬酸作为最重要的有机酸，外观呈白色颗粒状或结晶粉末状，具有令人心怡的强酸味，安全无毒并且可以被人体直接代谢，作为食品添加剂被广泛应用于各行业；同时，柠檬酸是世界需求量最大的有机酸，也是世界上产量最大的发酵产品之一1。随着发酵工艺的日益改善，我国目前主要是应用黑曲霉柠檬酸产生菌进行深层液体发酵来获取柠檬酸，这也是当今柠檬酸生产的主流技术2 ，目前世界柠檬酸的产量大约 160 万吨，中国作为柠檬酸出口第一大国，每年产量约 90 万吨3，并且产量仍然在继续上升，在所有有机酸的市场中，柠檬酸市场占有率 70%以上，到目前还没有一种可以取代柠檬酸的酸味剂，足以证明柠檬酸的重要地位。1
3、1、概述概述1 1、柠檬酸的性质柠檬酸的性质柠檬酸从结构来看是一种三羧酸类化合物，它可以以无水合物或一水合物的形式存在：柠檬酸从热水中结晶时生成无水合物，在冷水中结晶则生成一水合物；柠檬酸是一种较强的有机酸，其水溶液显酸性，并且加热可以分解成多- 1 -种产物，与酸、碱、甘油等均会发生反应。2 2、柠檬酸在国内的生产简史柠檬酸在国内的生产简史4我国 1967 年在黑龙江和平糖厂建立了第一个柠檬酸生产车间，1968 年在上海酵母场首先以淀粉为原料深层发酵柠檬酸获得成功，20 世纪 90 年代初期天津工业微生物研究所开始研究以玉米粉为原料的生产工艺，并得到广泛的应用，而后，天津市工业微生物研究所、
4、上海市工业微生物研究所相继开展用黑曲霉进行薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究，并获得成功，从而确定了中国柠檬酸生产的这一主要工艺路线；薯干粉深层发酵柠檬酸，原料丰富，工艺简单，不需添加营养盐，产率高，是中国独特的先进工艺。2 2、柠檬酸发酵菌种的选育柠檬酸发酵菌种的选育由于柠檬酸是生物机体三羧酸循环的中间代谢产物，能够合成和分泌柠檬酸的微生物种类很多，但是目前用于大规模工业化生产的只有黑曲霉（Aspergillus niger）菌种5。目前我国柠檬酸生产厂家主要应用的还是天津工业微生物研究所研究选育的黑曲霉 TD-01，和上海工业微生物研究所研究选育的黑曲霉 Co-827。这两株菌株具有以下优
5、良的生物特性6：最高能耐 200g/L 左右的初糖浓度，能耐高浓度的柠檬酸，在柠檬酸含量高达 220g/L 的培养基中不影响其生长发育，并且不会分解和代谢柠檬酸，能产生和分泌大量的高活性酸性 -淀粉酶和酸性糖化酶，在黑曲霉水解大分子多糖的时候，其分泌的酸性 -淀粉酶，能耐最低 pH 为 2.0，其分泌的糖化酶最低能耐 pH 值 4.04.6，抗微量金属离子的干扰，特别是能抗锰离子、锌离子、铜离子和铁离子，微量金属离子的存在下不影响其产酸量，在发酵过程中孢子发育生成直径 0.1mm 左右的菌丝球。1 1、柠檬酸产生菌的筛选柠檬酸产生菌的筛选7柠檬酸产生菌的分离筛选有两种方式，一是收集相当数量的现
6、有菌种，经过分离纯化，从中挑选出优良菌种；二是从自然界中采集大量的含菌样本，分离筛选出优良菌种。若是通过采集含菌样本来分离选育，一般要将含菌样本适当增殖培养，或者将样本的稀释液 100ml 和 10%薯干粉、10%柠檬酸混合，在振荡摇床上于 33-35下培养 3-5d，然后进行分离筛选。- 2 -2 2、产生菌的诱变育种产生菌的诱变育种一般情况下，从自然界分离出来的产柠檬酸菌株都需要经过诱变育种才能获得高产菌株；最常用的方法有两种：化学诱变剂和物理诱变因子；目前国内普遍使用的柠檬酸产生菌 Co-827 菌株产柠檬酸 13%以上，糖酸转化率为 95%以上8。3 3、柠檬酸发酵工艺流程柠檬酸发酵工
7、艺流程柠檬酸的生产方法可以从天然植物中提取和微生物发酵这两种，目前以微生物发酵法生产柠檬酸为主。根据所选用的菌种、原料、发酵条件的不同，生产方法也不样，工业生产方法有表面发酵法、固体发酵和液体发酵法；国内柠檬酸的工业化生产则都是采用液体深层发酵工艺。1 1、发酵原料的选取发酵原料的选取9我国柠檬酸生产的主要原料包括淀粉、葡萄糖、玉米粉、稻米粉、木薯粉等，现在工业化生产大都用薯干，玉米粉为原料。在我国 20 世纪 90 年代以前柠檬酸行业还主要是以薯干粉为原料发酵柠檬酸，这种方法生产的产品质量差而且成本高，环境污染严重；到 20 世纪 90 年代初期，天津工业微生物研究所开始研究以玉米粉为原料的
8、生产工艺，这样不仅有效地降低了成本，而且对于柠檬酸生产剩 余的副产物，通过优化工艺的方式加以合理的利用，减少了废物排放量，有利于环境保护，因此得到广泛的应用。2 2、发酵培养基的配制发酵培养基的配制10黑曲霉柠檬酸产生菌是化能异养微生物，只能利用有机碳源。为了满足黑曲霉的生长、繁殖，必须提供足够的碳源、氮源和无机盐，是培养基中的化学物质元素组成和菌体物质元素组成相当，但要使黑曲霉柠檬酸产生菌大量生成和积累柠檬酸，必须控制营养物质的供给，提供高浓度的葡萄糖和充足的氧，对于无机盐物质（如磷、锰、铁、锌等）要求则处于低水平。（1）斜面培养基：采用土豆琼脂培养基；（2）种子培养基：15%的玉米粉液化液
9、；（3）发酵培养基：25%的玉米粉 -淀粉酶液化清液，补充适量玉米浆作氮源。- 3 -3 3、发酵条件的控制发酵条件的控制对于发酵罐内温度，pH，溶解氧等都需要进行严格的控制，要使其与黑曲霉柠檬酸产生菌的生长同步。温度一般为 33-37，低于 28时菌生产速率太慢不适于柠檬酸的生成，高于 37则会使其他杂酸产生量增加，不利于后期的分离纯化11；对于 pH，发酵前期控制在 4.5 左右，而在柠檬酸积累时期（也即产酸期）则为 2.0-3.012；对于溶解氧，随着菌的生长需氧量也不同，一般当罐内的菌处于对数生长期时需氧量达到最大，而当其开始产酸时，耗氧量则维持在一个相对恒定的较低的水平13。4 4、
10、液体深层发酵的流程液体深层发酵的流程目前国内生产柠檬酸的液体深层发酵流程14四、产品的分离提取四、产品的分离提取发酵液除含有柠檬酸和水，还包括菌体、残糖、蛋白质、色素、有机杂酸、无机盐等多种杂质，需要通过各种物理化学方法脱除杂质，才能得到符合国家标准的柠檬酸产品。国内普遍采用柠檬酸提取工艺为钙盐离子交换法，但是存在工艺复杂，回收率低，能耗大的缺点15；国内的一些文献针对提取工艺做了改进，包括吸附法、萃取法、膜分离法以及工业色谱法等，但是都存在一些问题，因此还在继续的深入研究。以下简要介绍一下钙盐离子交换法的流程16：- 4 -五、五、柠檬酸的应用柠檬酸的应用柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理性
11、能、化学性能、衍生物的性能，是广泛应用于食品、医药、日化等行业最重要的有机酸。1 1、食品工业食品工业柠檬酸有温和爽快的酸味，能够改善食品的感官性状，增强食欲和促进体内钙、磷物质的消化吸收，因此可以用作各种饮料酒水的酸味调节剂，以及食用油的抗氧化剂，同时，柠檬酸的酯类可以作为无毒增塑剂被用于食品塑料膜包装。 2 2、化工环保化工环保柠檬酸在化学技术上可作化学分析用试剂，用作实验试剂、色谱分析试剂及生化试剂，用作络合剂、掩蔽剂，用以配制缓冲溶液。采用柠檬酸或柠檬酸盐类作助洗剂，可改善洗涤产品的性能，可以迅速和沉淀金属离子，防止污染物重新附着在织物上，保持洗涤必要的碱性，使污垢和灰分散和悬浮，提高
12、表面活性剂的性能，是一种优良的鳌合剂。服装的甲醛污染已是很敏感的问题，柠檬酸和改性柠檬酸可制成一种无甲醛防皱整顿剂，用于纯棉织物的防皱整理，不仅防皱效果好，而且成本低。 3 3、医药抗凝医药抗凝在凝血酶原激活物的形成及以后的凝血过程中，必须有钙离于参加；柠檬酸酸根离子与钙离子能形成一种难于解离的可溶性络合物，因而降低了血中钙离子浓度，使血液凝固受阻，柠檬酸钠在输血或化验室血样抗凝时，用作体外抗凝剂。 六、展望六、展望- 5 -对于目前国内柠檬酸的发酵生产，有几下几个方面需要不断改进：首先，中国是一个地大物博的国度，因此生产柠檬酸的原料很广泛，可以用一些更廉价易得的原料来取代木薯粉、玉米粉等这些
13、价钱昂贵的粮食型原料；其次，我们可以不断的筛选出能够使用于更广泛的原料的菌株，更加高产的生产柠檬酸的菌种，可以尝试太空诱变菌种等方法；再次，对于发酵过程，可以从设备上来改进，或者是从产品分离提取上使工艺更先进化，从而提高产率和回收率。总之，柠檬酸的发酵生产工艺一定会随着科技的进步越来越好。参考文献参考文献1石坡,杨冠翼,杨萍,姜文侠,孙文敬,刘敬泽.柠檬酸发酵的生产原料研究进展.商情,2011(36):178-1792高年发,杨枫.我国柠檬酸发酵工业的创新与发展.中国酿造,2010(7):1-63孙荣,王燕,杨平平.柠檬酸发酵现状及展望.中国调味品,2011,36(1):90-964程殿林.微
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