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1、农业生物技术学报，2010年，第18卷，第4期，第689694页 010，8，689694 研究报告 A 种从薏仁种子中提取出来的抗真菌蛋白 韦璐 ，许文涛 ，2，屈伟 梁志宏 王金爱 黄昆仑 1中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2农业部转基因生物食用安全检验监督测试中心北京100083 同等贡献作者 籼 通讯作者63要利用离子交换色谱柱、亲和层析色谱柱、凝胶过滤柱和反相高效液相色谱柱从薏仁(子中分离纯化出一种抗植物病原真菌的蛋白，经3。经蛋 白的相对分子质量为25 对链格孢菌 绿色木霉(小麦赤霉 (明显抑制作用，其半抑制浓度分别为915、450和1221 。观察该抗真菌蛋
2、 白对霉菌菌丝形态的影响，在透射电镜下可以看到霉菌细胞壁变厚以及变形，细胞壁和细胞膜问间隙变大， 细胞壁出现孔洞，细胞内容物渗出，细胞器受到严重破坏。 关键词薏仁抗真菌蛋白，透射电镜 A i u 1 00083， 00083，he 63039696747968201004010 25 kD by ts to 823he to 5 kD t in a of 28o-izm,2，5，450 221 p，of 物生物技术研究的一个重要目标就是通过增 加农作物的抗性来提高产量抗病育种在世界范围 内显得尤为重要。有关植物与微生物相互作用的分 子生物学的研究表明，作为小分子的抗真菌蛋白基 因转入植物将大大
3、提高农作物的抗病性(舒琼芳和 孙勇如，1997)而且，来源于植物的抗真菌蛋白基因 更易在植物中表达和调控。因此，植物抗真菌蛋白转 基因研究正成为重要课题。993)将大麦 硫堇基因转入烟草，获得了高抗病烟草，检测到的硫 堇表达量达每克鲜叶含20 g，对两种植物病原菌 y- 外还有番茄的基因，大 白菜防御素002)，大麦脂转 移蛋白(997)，玉米的039696747968201004010 基金项目：本研究由国家自然基金项目(0800770)国家高技术研究发展计划(863)项目(006同资助 收稿日期：20090119 接受日期：20090216 农业生物技术学报 690 御素基因，美洲商陆 一
4、 基因，核糖体失 活蛋白基因r 等在转基因植物中都取得了明显的 抗病效果。总之，植物抗真菌蛋白有着分子量小，抗 菌谱广，耐药性等特点。植物抗真菌蛋白基因是植物 基因工程中的一种理想抗病材料。 薏仁r 一种可供药用的谷 物。薏仁具有抗肿瘤、降血糖、免疫调节、抗病毒等作 用(赵素霞等，2004)。本实验以薏仁种子为实验材料， 利用离子交换色谱、亲和层析色谱、凝胶过滤和反相 高效液相色谱，分离纯化得到一种相对分子质量为 25 验对该蛋白的热稳定性和抑 菌活性进行了检测并通过透射电镜观察其对霉菌 菌丝的影响。与目前已经研究报道的薏仁种子抗菌 蛋白相比较(刘静等，2008)，该抗真菌蛋白很可能 是一种全
5、新的蛋白 1结果与分析 11抗真菌蛋白的色谱柱分离纯化以及纯度鉴定 0 50 100 150 200 250 t 0 30 40 50 C t品经离子交换色谱柱得到5个峰(图1 A)。具 有抑菌活性的是峰中峰更明显，峰此采用峰下一步分离纯化。将4个峰，具有活性成分的是峰1 B)。再将 有活性的是 峰1 C)。著的大峰液相工作站31计 算，纯度已达9823，代表了本实验分离出来的抗 真菌蛋白)。 12蛋白质相对分子质量的测定 经过蛋白表现为单一条带， 分子量在25 2)。 13抗真菌活性 薏仁25 色木霉和 小麦赤霉均有明显抑制作用(图3)。抑菌圈越大，表 示抑制效果越明显。 0 25 50 7
6、5 100 D t1抗真菌蛋白的色谱分离纯化 A：离子交换柱610 ：亲和层析柱：凝胶过滤柱5 030分离： D：反相高效液相色谱0018分离 by ：610 F ：el ：5 030 ：0018 o O 0 0 m 舳 们 加 A 692 眦 16抗真菌蛋白对菌丝形态的影响 用5薏仁25 菌3 过透射电镜观察，正常生长的链格孢 菌菌丝细胞结构规整清晰细胞质均匀，分布有序 (图6A、B)。经抗真菌蛋白处理后，细胞壁和细胞膜 间间隙变大(图6 C)，细胞壁出现孔洞，细胞内容物 渗出(图6 D)，菌丝细胞壁变厚以及变形，细胞器受 到严重破坏)。 2讨论 本实验从薏仁中提取出了一种新的抗真菌蛋 白，
7、通过子量为25 刘 静等(2008)从薏仁中提取的38 分子量并不相同，两者为不同物质。与38 白相比，本实验使用了不同的色谱柱来达到纯化 目的。实验表明，薏仁中存在不止一种抗真菌蛋白， 其粗蛋白样品表现出来的抗真菌活性应是其共同作 用的结果。 蛋白质和多肽的空间结构是它发挥功能的基 础。天然活性成分在分离纯化时。尽可能保持这种构 象。有些蛋白受外界温度影响较大温度越高，越容 易变性，造成活性丧失(汪家政和范明，2000)。薏仁 25 浴10 抑菌活 性仍与未加热样品无明显差别，但是在70水浴10 活性很弱，抑菌效果明显降低。所以，在大 规模提取纯化初期，可以用60水浴10 杂蛋白。 薏仁25
8、 A 而对真菌有较明显的抑制，因此选择了在自然界中 广泛存在的植物病原菌做检测。经检测，它能够抑制 多种真菌对今后用于生物防治、食品防腐和药物开 发具有一定价值。但由于实验室菌种和时间所限，要 获得更加详细的抗菌谱，需要收集更多的病原菌进 行测试。 通过透射电镜的观察发现其对于菌丝形态有 很大的影响。目前还没有详细的研究证明其作用的 位点以及如何起抑制作用的。国内外对于抗真菌蛋 白作用机理研究。主要是认为抗真菌蛋白主要通过 形成离子通道直接破坏细胞膜以杀死病原真菌从 而达到抑制真菌的目的(郭柏寿等，2005)，但具体作 用模型还有待进一步研究。 本实验对薏仁25 真菌菌丝形态的变化，对孢子萌发
9、、膜透性及体内 物质泄露、呼吸作用的抑制等研究尚未涉及。其抑菌 活性也集中在真菌上。没有涉及对病毒和肿瘤细胞 的作用。而病毒病(如艾滋病、肿瘤(癌症) 成为当今医学界最棘手的疾病。应研究该抗真菌蛋 白对病毒和肿瘤的活性作用为研发新型抗生素和 抗肿瘤药物提供理论依据。如想开发为药物或食品 防腐剂还需对其进行生物安全性评价如对动物 (小白鼠、家兔等)进行急性、亚急性毒性实验，以及 “三致”实验(致畸、致癌、致突变)等。 3材料与方法 31材料 薏仁(子购于北京物美超 B C D E 图6透射电镜下的链格孢菌菌丝形态变化 A、B：空向对照，正常生长的链格孢菌菌丝；真菌蛋白处理3 胞壁和细胞膜间阃麒变大r C t)；细胞壁胞
