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1、农业生物技术学报，2010年，第18卷，第4期，第753759页 010，8，753759 研究报告 牛体外成熟卵母细胞与保华 刘闯徐红强赵晓娥 西北农林科技大学动物医学院，农业部动物生殖生理和胚胎工程重点开放实验室，杨凌712100 通讯作者，要 比较了精卵的卵裂率和胚胎发育率。x 分离冻精组受精卵的卵裂率(5 14)和囊胚发育率(197)显著低于未分离冻精组(679，299， O05)； 微量上浮非离心法处理受精卵的卵裂率(507，655)高于上浮离心法处 理组(483，638)，但两种处理方法之间无统计学差异( 005)；同一种精子采用微量上浮非离心法或上 浮离 处理后，其卵裂胚的桑葚胚
2、发育率和囊胚发育率无统计学差异(尸 O05)；细胞和睾丸支持细胞共培养后，其卵裂率(500，514)与非共培养组(503)无显著差异( 005)；两 个共培养组的桑葚胚发育率(533，546)和囊胚发育率(211，215)均高于对照组(522，204)，但 无统计学差异( 005 o 关键词外受精，共培养，胚胎，奶牛 n v a u 12100039696747968201004020 he in he of of 1479，19005)no in of O00 14)of Oof 03P005)33461 211151 of O22 041，no 005) n o奶牛业繁殖育种中，自然条件下
3、所生产犊牛 性别比例为1：1，但只有雌性犊牛才具有生产意义， 03969j6747968201004金项目：本研究由863计划现代农业技术项目(008008陕西省重大科技攻关项目(006同资助。 收稿日期：20090226 接受日期：2009农业生物技术学报 斗 性犊牛的生产意义则不大，因而在一定程度上降低 了奶牛业的经济效益。20世纪80年代中期以后，以 牛为代表的家畜体外受精( F) 技术迅速发展。1982年第一头牛的体外受精后代出生 (et 1982)。随着流式细胞仪的发明与应 用，以及以现(979)，使得x、。X、分离纯度已经 能达到8595(007；et 2008)。 在目前的精子性
4、别分离研究与应用中，所采用精子 性别分离技术在单位时间内分离精子数量一般都有 限，每份性别分离冻精的有效精子数一般在200万 左右，而且性别分离操作会在一定程度上降低精子 活力。如果使用性别分离精子进行常规人工授精，妊 娠率仅有1550(Xu，et 2009)，而且消耗的 冻精细管数量(23支)也较常规冻精为多(熊杰等， 2006)，因而综合成本较高。随着 00个左右的精子就可使一个卯母 细胞受精(et 1 993)，与人工授精相比较较为 经济。因此，将性别分离精子应用于技术相结合，将会较大限度地提高性别分离精子 的应用价值，促进奶牛业的发展。然而性别分离精子 在分离过程中受到高倍稀释、分离压
5、力、核荧光染色 和激光照射等因素的影响，其体外受精效率和胚胎 发育率总体上比较低(et 2005；陆阳清，2004； Saet 2004)。如何提高性别分离精子的体外受 精率和受精卵的体外发育率是性别分离精子应用研 究的技术基础。本研究的目的一方面是通过改进精 子获能处理方法来提高牛另一方面利用颗粒细胞(C)和睾丸支 持细胞(C)与体外受精卵共培养以提高 性控胚胎的体外发育率。 1结果与分析 11 的胚胎体外发育 分别用行体外受精，受精后胚胎的体外发育结果见表】。 由表1可知，分别用成熟牛卵母细胞进行体外受精，其受精卵的卵裂 率(51479)、桑葚胚发育率(551668)和囊胚发育率(1979
6、9)均具有差异 显著性(5)；受精 卵的桑葚胚发育率(55736：675658)和囊胚发育率(20894；3163 12)均无统计学差异(PO05)。说明精子处理方 法不影响受精卵的继续发育。 13性控胚胎与体细胞共培养时的体外发育 表1 l in of 一列数据上标不同小写字母表示这两组数据差异显著(5)；两个共培养组的受精卵发育到桑 葚胚和囊胚的比率均高于对照组，但无显著差异 ( 005)。著差异，但1 G)性控胚胎在形态发育方 面优于1 H)。 2讨论 21精子性别分离对牛卵母细胞体外受精的影响 本研究中，用体外成熟卵母细胞受精后，分离冻精组相比受精卵的卵裂率(514679)、桑葚胚发育
7、率(55168)和囊胚发育 率(19799)均具有差异显著性(克服性别分离精 ：密度低的缺陷。微量上浮非离心法和上浮离心法的 ：要区别存在于精子离心与否和精子密度调节方法 。采用微量上浮非离心法，可以简化离心操作这一 骤，减少了实验操作环节，同时也避免了性别分离 3 前，在家畜(尤其在牛、羊和猪)上进行的大量 外胚胎培养研究中，较多地采用受精卵与体细胞 ；培养的方法来克服早期胚胎发育阻滞，促进早期 !胎的体外发育。为其它细胞培养的饲养细胞方面有许多文献报 道，但作为受精卵的共培养细胞，除本实验室外并无 其它报道。刘赛等(2008)报道，采用低密度接种的 传代牛胎儿受精卵的体 外发育，本研究所取
8、得的结果与其类似。体外受精卵体外发育的原因可能与其体外分泌活 性有关，分泌转铁蛋白 (005)、激活素(et 2003)、转移生长因子一仅(刘珠果等，2005)、胰岛素样 生长因子003)，类胰岛素生长因子 (et 2001)等有利于早期胚胎发育的生物活 性物质。997)用现 和 均有表达，推测 高卵母细胞的成熟度、受精力及受精后的卵裂率。 999)揭示了过氧化物酶体增殖物激活受体 8(导列环素)在胚胎附植中发挥 作用，在随后的研究中发现在卵巢和输卵管内都存 在005；008)。(2005)在研究邻苯二甲酸盐对肝脏和睾丸组织的 致癌和细胞凋亡报道中说明了 转录物和蛋白，这进一步提示了分泌转录物和蛋白而促进早期 奶牛体外成熟卵母细胞与
