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1、农业生物技术学报，2010年，第18卷，第4期，第807814页 010，8，807814 研究资源 丸酮丛毛单胞菌工程菌构建及稳定性分析 戴艺民 周以飞 陈建秋 林江波 张剑亮： 林龙云2 潘大仁2 1福建省农科院甘蔗研究所，漳州363005；2福建农林大学作物学院，福州350002 通讯作者、要本研究根据同源重组原理，利用电穿孔法将重组质粒毛单胞菌经对这两株基因工程菌的关键酶3 o【羟基类固醇脱氢酶碳酰基还原酶f3 cxR)表达情况和细菌稳定性的分析结果表明：两株基因工程菌在没有诱导剂诱导 的情况下，其3a加抗生素进行培养，两株工程菌的3 一在不添加抗生素的培养基上培养时，两株工程菌的R
2、的表达变化较大，蛋白总体表达水平比添加抗生素时低。研究结果可以初步推断，3 一关键词 睾丸酮丛毛单胞菌，3仅羟基类固醇脱氢酶碳酰基还原酶(3R)，程菌，稳定性 of te 1 63005， 50002，039696747968201004029 一lby by CR 一f3 R)of he o【一R 0一in of of R B B he xR be by o【一xR)，类将许多具有类似激素作用的化学物质排放 到环境中，干扰了动物的内分泌系统，引起生态破 坏，造成癌症、不育等各种各样的疾病(997； 杜克久和徐晓白，2000；et 2002)。类固醇 化合物的激素活性大大高于其它环境激素类物质
3、， 广泛存在于环境中，该类化合物相当稳定，难以降 解，如何降解这些稳定化合物已经引起广泛关注。 睾丸酮丛毛单胞菌(Cou一 种革兰氏阴性菌，具有降解类固醇化合物的关键性 酶3 0羟基类固醇脱氢酶碳酰基还原酶 (3仅3R)。由于具有碳酰基还原酶基因，该细菌 0396986747968201004029 基金项目：本研究由福建省科技攻关重点项目(0031福建省发改委重点项计投资(2003)170号)共同资助 收稿日期：20091221 接受日期：20100415 8。8 i。能对许多非类固醇的酮类(如杀虫剂2255)和 醛类的碳酰基起还原作用。研究表明，睾丸酮丛毛单 胞菌在降解类固醇、多环芳烃类物
4、质(稳定 污染化合物中具有重要作用(l 968； 996；et 1 997； 998；et 2000；2001； et 2002)，在污染环境修复中扮演着重 要的角色。睾丸酮丛毛单胞菌的3导酶，在该细菌染色体上3a在两个10 基因附近还 存在两个抑制子过转录和翻译抑 制该基因的表达(00 1；et 2001；2003a，b，c)。 活化因子(指与增强子或与活化因子 结合区域结合的蛋白，能够提高转录的起始速度 (004)。戴艺民等(2005，2006)将 来自睾丸酮丛毛单胞菌的全长(564 部分(409 bp)果表明睾丸 酮丛毛单胞菌的率。 由于人工合成和生物自身代谢排人环境中的类 固醇污染物与
5、日俱增，有必要对睾丸酮丛毛单胞菌 进行改造，提高该细菌的3a基因的表达，才能达到利用睾丸酮丛毛单胞菌快 速降解该类污染物、净化环境的目的。本研究利用电 穿孔法将重组质粒入睾丸酮丛毛单胞菌的染色体中，筛选得到2株 睾丸酮丛毛单胞菌基因工程菌，对这两株基因工程 菌的关键酶3 0【 检测分析，以期为进一步利用工程菌提供理论基 础 1利用粒电穿孔转化后的细菌在含有过夜培养。挑选单克隆在 含有培养，提取重组子的染色体增产物用1O的琼 脂糖凝胶进行电泳(图1)。筛选到2株基因工程菌， 即质粒色体产生的工程菌C 源整合人睾丸酮丛毛单胞菌染色体产生的工程菌 c两株基因工程菌能够在含有睾丸酮丛毛单胞菌 原始菌株
6、只具有能生长在含养基中生长，不能在含有这两种抗生素的培养基 中生长。 1 2 2500 2000 。 。 1000 750 500 250 1 图1 ：00)；1：C 2：C 2基因工程菌的取睾丸酮丛毛单胞菌野生菌(在图中简写为 C同)、C 酶切后进行杂交检测，以阴性对照，以 酶切，基因工程菌C丸酮丛毛单胞菌的染色 体于睾丸酮丛毛单胞 菌的染色体上不存在在挑选出来的 基因工程菌的染色体上能够检测到在，由此可见质粒合人睾丸酮丛毛单胞菌的染色体中。 13睾丸酮对细菌的诱导 睾丸酮丛毛单胞菌的3 0【的酶。在c睾丸酮的终浓度为270 别提取这3个菌 株的总蛋白，将细菌的总蛋白定量为J mg释 100倍后，用结果如图3所示。从图中可见，睾丸酮丛毛单胞菌野 睾丸酮丛毛单胞菌工程菌构建及稳定性分析 of 2基因工程菌的 of l：C ：e ：C ：testoster
