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1、TILLING 技术的原理与方法述评摘要TILLING，即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes（定向诱导基因组局部突变技术）， 是由美国 Fred Hutchinson 癌症研究中心Steven Henikoff 领导的研究小组发展起来的，是一种全新的 反向遗传学研究 方法。TILLING 技术借助高通量的检测手段，快速有效地从由化学诱变剂（EMS）诱变过 的突变群体中鉴定 出点突变。目前，TILLING 已被应用于多种生物的研究中。本文系统介绍了TILLING 技 术的基本原理、技术 路线及其技术优势，同时列举了TILLING 的应用实例，并展
2、望了TILLING 技术的应用前 景。关键词TILLING, 点突变, 检测Introduction to the TILLING StrategyWu Haibin1,2 Zhu Rucai2 Zhao Degang1*1Guizhou Key Laboratory of Agricultural Bioengineering, Guizhou University, Guiyang, 5500252 Hainan Provincial Key Laboratory of Crop Molecular Breeding, Sanya, 572025*Corresponding author,
3、 ABSTRACTTILLING，Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，was developed by Dr. Steven Henikoff s Research Group of Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle, Washington, USA. TILLING is a novel reverse genetics strategy that provides a completely solutions for high throughput and low cost
4、discovery of induced point mutations in populations of chemically mutagenized individuals. Recently TILLING has been applied to lot of organisms such as arabidopsis, tomato, maize, rice, soybean, lotus, nemetode, mouse, zebrafish, drosophila etc. This paper briefly introduced the TILLING methodologi
5、es and its advantages, and also listed the Arabidopsis TILLING Project as an application case.KEYWORDSTILLING, Point mutations, Detection TILLING， 即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes（定向诱导基因组局部突变技术），是由美国Fred Hutchinson 癌症研究中心Steven Henikoff 领导的研究小组发展起来的，是一种全新的反向遗传学研究方法。主要的技术论文先后发 表在PlantPhysi
6、ology、Nature Biotechnology、Genome Research等学术刊物上。TILLING 已 成为自动化反向遗传学解决方案的关键词，以美国为首的北美实验室借助高通量的 TILLING 技术，启动了拟南芥TILLING项目（Arabidopsis TILLING Project），获得美国国 家科学基金会植物基因组计划（Plant Genome ResearchProgram，PGRP）大力资助，在ATP 项目组内 部已经实现了材料、DNA 样品及突变信息的充分共享，该项目在立项的第一年里就为拟 南芥研究者们提供了超过100 个基因上的1000 多个突变位点。 国际上也有
7、许多研究机构以TILLING 作为技术平台，展开了各自感兴趣的目标生物的功能 基因组学研究。TILLING 技术借助高通量的检测手段，快速 有效地从由化学诱变剂（EMS）诱变过的突变群体中鉴定出点突变。目前，TILLING 已被 应用于多种生物的研究中。本文系统介绍了TILLING 技术的基 本原理、技术路线及其技术优势，同时列举了TILLING的应用实例，并展望了TILLING 技 术地应用前景。1 TILLING 技术路线TILLING 利用化学诱变方法（Chemical mutagenesis）来产生一系列的点突变，经过PCR 放大，PCR片段变性退火，产生异源双链核酸分子（Hetero
8、duplex）， 再利用CELI 核酸酶处理后，进行双色电泳分析。TILLING 的具体操作步骤是（图1）： EMS（Ethyl Methane Sulfonic acid）处理种子，诱导产生一 系列点突变； 将种子培养，获得第一代突变个体M1）； M1 植株自花授粉，产生第 二代植株（M2）； M2 植株抽提DNA 存放于96 孔微量滴定板，并 保留M2 代种子； 将多个96 孔板的DNA 样本合并到一个96 孔板内（最多可合并8 个） 得到DNA池； 根据目标基因序列设计一对特异性引物进行 PCR 扩增，两个引物分别用700nm 和800nm 荧光染料标记； PCR 扩增片段变性、退 火，
9、从而得到野生型和突变型所形成的异源双链核酸分子； 用特 异性识别并切割错配碱基的核酸内切酶剪切异源双链核酸分子； 酶切产物用变性的聚丙 烯酰胺（DPAGE）凝胶电泳分离，然后用标准的图象处理程 序分析电泳图象，获得突变池； 利用相同方法从突变池中筛选突变个体； 突变个体 PCR 片段测序验证； 突变表型鉴定（Colbert et al., 2001; Till et al., 2003）。图1 植物中TILLING 的技术路线(Colbert et al., 2001)Figure 1 Schematic depicting the TILLING strategy applied to a
10、plant (Colbert et al., 2001)TILLING 技术的原理与方法述评Introduction to the TILLING Strategy 575分子植物育种Molecular Plant Breeding最初的TILLING 是利用DHPLC 对DNA 池中的突 变进行检测（McCallum et al., 2000a; 2000b）。为了 进一步提高这个方法的效率，适应大规模筛选的要 求，Colbert 等（2001）对TILLING 作了改进。他们将 所获PCR 片段先用特异性识别错配碱基的内切酶 酶切异源双链核酸分子，再用变性的序列胶电泳分 离酶切产物，用标准
11、的图像处理程序分析点突变的 存在。有几种酶已经被用于错配碱基的特异性识 别、切割，包括S1 核酸酶（Howard et al., 1999）和T4核酸内切酶（Youil et al., 1996）。目前，使用较多 的是S1 核酸内切酶家族中的CELI 酶，它是一种从 芹菜（celery）中分离出的植物所特有的核酸内切酶 （Oleykowski et al.,1998）。CELI 酶能够识别错配碱 基并在错配碱基的3 端进行切割，再用变性的序列 胶（PAGE）分离酶切产物，能够将超过1kb 的PCR 扩增产物内的点突变定位在几个碱基对内。因此， 改进的TILLING 充分运用了CELI 酶和凝胶
12、电泳技 术，从而使其成为一个低成本、高通量的筛选突变 基因的技术平台。 1.1 TILLING 中的引物设计 根据目标基因序列设计引物，是TILLING 中可 操作性较强的一个步骤，引物设计的好坏直接影响 TILLING 筛选的结果。为此，Nick Taybr 和ElizabethA. Greene (Fred Hutchinson Cancer ResearchCenter, Seattle; http:www.proweb.org/coddle)为 拟南芥TILLING 项目（Arabidopsis TILLING Project， ATP） 研究开发了CODDLE (Codons Opt
13、imized to Discover Deleterious) 程序。CODDLE 能够识别各种 形式的序列信息，并能根据输入的碱基序列产生基 因模型和蛋白质保守区域模型（Henikoff et al., 2000）。CODDLE 能够列出EMS 诱导植株产生有害 突变的可能范围，当1000bp 左右的区段被选中后， 系统就会根据最有可能突变成为高频率终止密码子的区域或进化保守区域（McCallum et al., 2000b）设计引物。设计完成后，研究人员可以用Primer3 程序（Rozen and Skaletsky, 2000）对CODDLE 列出的候选引物进行选择。 1.2 TILL
14、ING 中的点突变检测 通常点突变很难被检测，一直是TILLING 应用 上的一个障碍。要得到好的结果，要求检测仪器不 仅要灵敏度高，还要能够准确识别假阳性位点。 Collbert 等（2001） 将双色红外荧光扫描系统（Mid dendorf et al., 1992）引入TILLING 中，大大提高了 筛选效率。由于杂质、干扰分子在红外光区几乎不 发光，用红外荧光检测的背景非常低，灵敏度高，能 够对由8 个DNA 样品组成的DNA 池中检测出 100 atto moles 的CELI 酶切产物。加上双通道检测 （680nm 激发，710nm 检测；780nm 激发，820nm 检 测），两
15、个通道检测波长相距110nm，几乎没有光谱 重叠的干扰，保证TILLING 分析中每一个突变碱基 的准确识别及整个检测的灵敏度。在两个通道的电 泳图上的相同泳道都可以检测到新的条带。用UNIX 程序“grab”（http:www.imagemagick.org）可以 将LI-COR 扫描仪上的图像文件处理成适合于 Adobe Photoshop 分析的JPEG 压缩文件，并进行存 档。图2 是一张典型的双色红外荧光检测电泳图谱。由于两个剪切片断采用不同的荧光染料标记， 发生突变的泳道，在700nm 的图上可以在野生型条 带下方看到一个条带，同时在800nm 的图上的相同 的泳道也会有一个条带，
16、这两个条带就是CELI 核 酸酶的剪切产物，两个条带片段大小之和等于扩增 片段的大小，从而很容易对扩增产物进行突变检 测。近似的迁移距离可以通过对比Mr 得出。Photoshop 图像处理工具能够容易的确定出发生突变的 泳道和突变带的迁移距离(Colbert et al., 2001)。 1.3 TILLING 中的突变体鉴定 一旦在一个DNA 池中检测到了一个突变，那 么就要对这个DNA 池中每一个单株的DNA 样品 进行筛选。单株的DNA 样品可以排列在一个88 的微量滴定板中，每一个DNA 池对应一排(8 个) DNA 样品。用一个有8 个吸头的移液器将阳性 DNA 池对应的8 个DNA 样品转移至一个新的微 量滴定板（812）中。因此每块板可以对12 个阳性 的DNA 池中的所有单株进行筛选。利用UNIX 程 序（pick）可以方便的将要筛选的每一块96 孔板的 每一行与阳性DNA 池对应起来，并能以表格的形 式将结果输出。为了能够检测出突变，每一个单株 的DNA 样品中等量混入野
