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1、实验二实验二 对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色 谱法分析谱法分析一一 目的要求目的要求1.学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量；2.熟悉高效液相色谱分析操作。二二 基本原理基本原理高效液相色谱法（HPLC）是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它的基本概念与理论基础，如保留值、塔板理论、速率理论、容量因子、分离度等，与气相色谱法是一致的，但又有不同之处。高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点。（1） 流动相的不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；（2） 由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在
2、液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小 45 个数量级；（3） 由于流动相的化学成分可进行广泛的选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗提的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率（柱效能） ；（4） 高效液相色谱采用 510m 细颗粒固定相，使流动相在色谱柱上渗透性大大减少，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相；（5） 高效液相色谱是在液相中进行，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如：紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等。与气相色谱相比较，高效液相色谱同样具有高灵敏、高效能和高速度的特点，但它的应用范围更加广泛。据估计在自然界数百万种有机化合物中，仅有20%可
3、以不经过化学预处理，直接采用气相色谱法分析，而对于总数的75%80%，则可采用高效液相色谱进行分离分析，特别是许多高沸点、难挥发、热稳定性差的物质。如生物化学制剂、金属有机络合物等物质的分离分析，尤须借助于高效液相色谱方法。目前高效液相色谱已得到愈来愈广泛的应用。根据固定相的类型和分离机制，高效液相色谱可分为：液-固吸附色谱，液-液分配色谱，离子交换色谱和凝胶渗透色谱等几大类。高效液相色谱的定性和定量分析，与气相色谱分析相似，在定性分析中，采用保留值定性，或与其他定性能力强的仪器分析法联用，如与质谱法、红外吸收光谱法等联用。在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等，但高效液相色
4、谱在分离复杂组分试样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而内标法定量则被广泛使用。在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，他们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的 C-18 烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。由于在一定得实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在各种条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类各组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。这种利用纯物质对照进行定性的方法，适用于来源已知，且组分简单的混合物。本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计
5、算公式与气相色谱分析相同：%ci=(fiAi/nfi.Ai)100 对羟基苯甲酸酯类混合物属于同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相同的校正因子，故上试可简化为： %ci=(Ai/ni=1.Ai)100三三 仪器仪器高效液相色谱（HPLC）系统四四 试剂试剂1.对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲醇等均为分析纯。2.纯水 去离子水，再经过一次蒸馏3.标准溶液的配置（1） 标准贮备液 分别于四只 100mL 容量瓶中，配制浓度均为 1000 g.mL-1的上述四种酯类化合物的甲醇溶液。（2） 标准使用液 用上述四种标准贮备液分别于
6、四只 10mL 容量瓶中，配制浓度均为 10g.mL-1的酯类化合物的甲醇溶液，摇均备用。（3）标准混合使用液 于一只 10mL 容量瓶中，用上述四种标准溶液贮备液，配制浓度均含 10 g.mL-1 的酯类混合物的甲醇溶液，摇均备用。五五 实验条件实验条件1.色谱柱 长 15cm、内径 3mm，装填 C-18 烷基键合相颗粒度为 5m 的固定相2.流动相 甲醇：水（55:45） ，3.流速 1mL.min-14.检测器 DAD 检测器，254 nm，灵敏度 0.04六六 实验步骤实验步骤1.将配制好的流动相甲醇水溶液置于超声波发生器上脱气 15min。2.根据实验条件，将仪器按照仪器操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡时，图谱基线呈平直，即可进样。3.依次分别吸取 5L 的四种标准适用溶液及标准混合使用液个未知试样液进样，记录各色谱图，并重复两次。在每次进样后，于进样信号附近标明进样溶液名称。七七 数据及处理数据及处理1.记录实验条件2.测量四种对羟基苯甲酸酯化合物色谱图的保留时间，并列表。3.依次测量标准混合液色谱图上各色谱峰的保留时间值，然后与上表数据对照，确定各色谱峰代表何种化合物。4.测量未知试样色谱图上各组分的峰高 h、半峰宽 Y1/2，计算各组分峰面积 A及其含量%Ci。
