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1、 技术与方法生物技术通报 B IOTECHNOLOGY BULLETIN2009年第6期细胞分子生物学技术在靶向药物筛选中的应用刘明1赵琦1李亚男1胡文祥2(1首都师范大学生命科学学院,北京100048;2首都师范大学物理有机与药物化学研究所,北京100048)摘 要: 随着细胞及分子生物学的发展,新技术方法越来越多地用于新靶点建立和药物筛选研究,为药物设计、 靶点的选择和用药方案的确定提供理论依据,同时使药物筛选有了更高的特异性,对药物筛选和药理学研究起到了极大的促进作用。 论述了功能基因的筛选、 高通量细胞筛选和高内涵筛选技术、 反义核酸技术、 转基因/基因敲除技术、 基因芯片、 蛋白质芯
2、片、 组织芯片、 酶免疫分析、 荧光免疫分析、 流式细胞技术等方法在靶向药物筛选中的应用。关键词: 生物技术 药物筛选 分子药理学 受体学Applications of Cell andMolecular Biotechnology in Targeted Drug Screeni ngLiu Ming1Zhao Qi1Li Yanan1Hu Wenxiang2(1College of Life Science , Capital Nor mal University, Beijing100048;2The Institute of Physical Organic and Medicinal
3、 Chem istry , Capital Nor mal University, Beijing100048)Abstract: W ith the development of molecular and cell biology, pharmacology, physiology, chemistry and pathology, growing bio2technologies were applied in the research of drug design and screening that has speeded up the rate of new drug develo
4、pment1This arti2cle summarized recent advances of molecular and cell techniques,such as expression profiling normal and diseased tissues , high2throughtput cell2based screening , high content screening, technology, gene chip, protein chip, tissuemicroarray, surface plasmon res2onanc, enzymeimmuoassa
5、y, fluorescenceimmunoassay and flowcytometer, which could help to improve the phar maceutical screening,pharmacology and receptorology research work to make great progress1Key words: Biotechnology Drug screening Molecular pharmacology Receptorology收稿日期: 2008212215 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 20872095) 作者简介:刘
6、明(19782) ,女,博士,副高级教师,研究方向:细胞及分子生物学,生化及分子药理学; E2mail: dianalm1261com 通讯作者:胡文祥,男,教授,博士生导师,研究方向:生物活性分子合成,药物制剂与分子药理学; E2mail: huwx661631com随着生物技术的迅速发展,细胞及分子生物学 技术越来越多地用于新靶点建立和药理学研究,直接用靶点作为筛选对象,寻找与其相互作用的药物, 对药物筛选和药理学研究起到了极大的促进作 用1, 2 。分子药理学研究的基本理论是受体学说, 受体的本质是蛋白质,对于受体的研究可以阐明药 物、 激素及神经递质的作用原理和生物信号转导机制,为药物
7、设计、 靶点的选择和用药方案的确定提 供理论依据3 。受体的分子生物学研究方法对受体的分子结构及基因序列研究起到了极大的推动作 用,并能阐明受体的结构与功能的关系。受体的研 究方法包括经典的放射配体结合法、 药理学方法、 蛋白质化学和生物化学方法、 免疫学技术和分子生物 学方法4 。人们对疾病的认识达到基因水平,对药 物作用的认识达到分子水平,新药研究也出现了新 高潮。细胞及分子生物学方法能在基因水平上研究 受体生理调节和病理变化的分子机制、 受体病的分 子基础以及细胞内受体与DNA相互作用的机制等。 1 基因克隆技术在确定药物靶点中的应用111 差异表达筛选新药靶点功能基因 获得候选基因的研
8、究路线之一就是通过正常和 疾病组织的表达谱差异分析(expression profiling ofnormal and diseased tissues)获得疾病的相关基因, 并进行基因功能的筛选研究(图1)。该筛选策略2009年第6期刘明等:细胞分子生物学技术在靶向药物筛选中的应用与疾病发生过程密切相关,较多地应用于新药及治 疗靶点的发现5 。图1 表达谱差异分析筛选功能基因研究的框架图112 高通量筛选和高内涵筛选在药物靶基因功能研究中的应用高通量筛选(high throughput screening, HTS)是药物开发的强有力工具。目前HTS广泛应用于发现作用药靶的活性化合物,评价先
9、导化合物的选择性、毒性等多个药物开发阶段,并在先导化合物的优化等过程中起着重要作用。高通量细胞筛选技术(highthroughput cell based screening technology)是以高通量方式研究基因功能最有效的方法之一。除与细胞表型或形态学相关的检测指标外,细胞信号转导通路、 糖代谢、 能量产生和代谢产物分析(metabolic con2trol analysis)等代谢通路也是基因功能重要的研究内容6。结合抗体芯片技术、 多路测定技术(multiple2xing)等新的检测方法和荧光成像读板仪(fluorescence image plate reader , FL I
10、PR)、 定量PCR、 高通量荧光激活细胞分类器(HT2FACS)等检测方法和技术的不断发展和应用,灵敏度和重现性这两个高通量细胞筛选的关键问题也逐步得以解决。近几年, HTS技术进一步微量化和自动化,形成超高通量筛选(ul2trahigh throughput screening, uHTS)。uHTS采用微量化技术和更灵敏的检测方法以及高度自动化进样系统与数据管理系统,进一步提高药物筛选的效率并降低成本,检测微量化和操作自动化是uHTS的关键 技术7。高内涵筛选(high content screening, HCS)是通 过显微成像法记录多孔板内的细胞图像,并分析图 像中的信息来筛选药物
11、的技术。HCS是一种基于细胞层面的、 多元的药物筛选方法,它主要依赖于高 分辨率的细胞成像系统,充分整合样品制备技术、 自 动化设备、 数据管理系统,检测试剂,生物信息学等 资源的综合优势,在细胞或分子水平上实现对候选 物的多元化、 快速化和规模化筛选。在保持细胞结构和功能完整的条件下,尽可能同时检测被筛选样 品对细胞生长、 分化、 迁移、 凋亡、 代谢途径及信号转 导等多个环节的影响,涉及的靶点包括细胞的膜受 体、 胞内成分、 细胞器和离子通道等,即从单一实验 中获得大量与候选物药理学活性相关的信息及其潜在的毒性作用。与传统的HTS方法相比, HCS使用 单个细胞的形态、 结构等多方面的信息
12、来表征细胞 的生理或病理特性, HCS还能够用于亚细胞群或亚 细胞结构方面的研究。经过HCS筛选得到的阳性 化合物(hits)和先导化合物( leads)更可靠,并能有效地克服HTS成功率低的缺陷,使研究人员可以在 新药发现早期阶段就获得候选化合物对细胞多重效 应的详细数据,包括细胞信号转导、 细胞形态改变和 药物毒性效应等8 。113 反义核酸技术在药物靶基因功能鉴定中的应用 反义核酸技术(antisense technology)主要包括 反义RNA (antisense RNA)和反义寡核苷酸(anti2sense oligonucleotide) ,通过多种机制快速、 可预测地 调节培
13、养组织或细胞的基因表达,从而快速、 有效地测定基因功能。反义寡核苷酸主要通过RNase H 介导的机制抑制基因表达。这种高效的方法已被广 泛用于含有反义寡核苷酸序列样的靶基因的下调(down regulation)9 。实际上,这种技术对于鉴定mRNA中的有效靶基因在某种程度上靠经验,因为许多靶基因不能显示最佳活性,是一种高通量的基 因功能检定方法。反义技术广泛用于体内外模型中 靶基因功能的验证,可部分替代基因敲除技术。RNA干扰技术(RNA interference , RNAi)可以 特异性抑制靶基因转录后表达,成为研究转录后调36生物技术通报B iotechnology Bulletin
14、2009年第6期控的有效工具。美国科学家安德鲁 菲尔和克雷 格 梅洛因RNAi此而获得2006年诺贝尔生理学 或医学奖。RNAi为基因和蛋白功能研究、 核酸药物 的分子设计,药物靶点的发现、 疾病基因治疗等科学 研究提供了重要手段。RNAi可以高通量地发现药物靶基因,从而成为寻找新药作用靶标的有力工具。RNAi可高度特异性地干扰表达潜在靶点的基因,进 而干扰机体疾病的发生与发展,其效果与高特异性 靶蛋白的抑制效果类似。目前, RNAi已广泛用于探 索发现治疗肿瘤、 病毒感染性疾病、 神经退行性疾病以及血液病等疾病的药物靶标。siRNA的标记、 转 染和RNAi的检测10 等已广泛用于功能基因组
15、学、基因治疗和转录调控机制研究。国外许多药物研发 公司或大型制药公司已将RNAi作为高通量药物靶 标发现与确认的常用工具。此外, RNAi还可以与基础表达相结合,用于药物筛选以及药物作用机制的 评价。114 转基因技术在药物作用靶点研究中的应用 转基因技术通常包括基因敲入(knockin)和基 因敲除(knockout)两种方式,其显著特点是分子及细胞水平操作,组织及动物整体水平表达。转基因 技术的出现为体内研究药物对机体整体的作用提供 了很好的技术手段,在药物发现过程中起重要作用。 真核细胞的基因转染(gene transfer)技术是研究基 因功能的有效手段之一。动物的正常生理依赖于体内不
16、同类型细胞间的相互作用,后者通过细胞通讯 和信号转导实现由于一个基因功能的实现不仅会对 细胞和整体产生作用,同时也会受到来自细胞内外 的调控,因此,在正常或病理状态下的整体动物中进 行基因功能的评价和确证研究更为有效。通过对胚胎细胞进行基因工程改造或基因转染所获得的转基 因小鼠( transgene mice)和基因敲除(gene knock2out)小鼠,在整体水平上为研究基因功能和药物作 用靶点提供了极为有效的工具和模型,其技术也日 趋成熟。2 生物芯片在药物靶标筛选等研究的应用211 基因芯片在基因水平上寻找药物作用的靶标根据芯片上固定的探针不同,生物芯片包括基 因芯片、 蛋白质芯片、 芯片实验室等。另外根据原理 还有组件型微阵列芯片、 通道型微阵列芯片、 生物传感芯片等新型生物芯片11。基因芯片在用来研究药物的作用机理时,由于药 物与细胞,特别是敏感细胞相互作用,将引起细胞外 部形态及内部正常代谢过程的一系列变化,所以,通 过测定分析药物对细胞的基因表达的影响,可推测药物的作用机制,评价药
