免疫荧光技术简介

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1、免疫荧光技术简介免疫荧光技术简介技术支持 | 浏览次数：416 | 时间：2010-2-22 PriCells-PriCells-免疫荧光技术（免疫荧光技术（Immunofluorescence technique） 1941 年，Coons 等于首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标 记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点 是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还 比较复杂。 一、荧光免疫技术的概念：一、荧光免疫技术的概念： 免

2、疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记 免疫技术中发展最早的一种。将抗原或抗体用荧光素进行标记，标记的抗原或 标记的抗体与相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技 术称为免疫荧光素技术。免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体 法。 二、荧光免疫技术分类：二、荧光免疫技术分类： （1）荧光抗体显微镜技术：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测 方法。 （2）免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推 算被测物浓度的检测方法 三、荧光的产生：三、荧光的产生： 物质吸收外界能量而进入激发状态，

3、在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形 式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质，称为荧光素。由光激发所引起 的荧光，为光致荧光；由化学反应所引起的荧光，为化学荧光。 四、荧光素的荧光特性：四、荧光素的荧光特性： （1）停止供能，荧光现象随即终止 （2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性入射光波长发射光波长 （3）荧光效率：荧光效率=发射荧光的光量子数 /吸收光的光量子数 （4）荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱 五、常见荧光素：五、常见荧光素： （1）异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC 纯品为 黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶

4、剂。有两种异构体，其中异构体 型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC 分子量为 389.4，最 大吸收光波长为 490495nm，最大发射光波长为 520530nm，呈现明亮的黄绿 色荧光。FITC 在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要 优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 （2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200 为橘红色粉末，不溶于水， 易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大 发射光波长为 595600nm，呈现橘红色荧光。 （3）四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetr

5、amethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)： TRITC 为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为 620nm，呈现橙红色荧光，与 FITC 的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标 记染色。 （4）镧系：镧系螯合物某些 3 价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈 （Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以 Eu3 应用最广。 Eu3 螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适 合用于分辨荧光免疫测定。 （5）藻红蛋白（P-ph

6、ycoerythrin，PE）：PE 是在红藻中所发现的一种可进行 光合作用的自然荧光色素，分子量为 240kD 的蛋白，最大吸收峰为 564 nm，当 使用 488 nm 激光激发时其发射荧光峰值约为 576 nm，对于单激光器的流式细 胞仪来说，推荐使用 58521nm 的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使 用 57513nm 的带通滤光片。FL2 探测器检测 PE。 （6）多甲藻叶绿素蛋白 （peridinin chlorophyll protein，PerCP）：PerCP 是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为 35kD，最大激发波长的峰值在 490n

7、m 附近，当被 488nm 氩离子激光激发后，发 射光的峰值约为 677nm。FL3 探测器检测 PerCP。 （7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）：可选择性地嵌入核酸 （DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对 DNA 染色时，需用 RNase 对细胞进行处 理，以排除 RNA 对 DNA 荧光定量精度的影响。在 488nm 波长激发下，PI 的发射 光谱为 610-620nm。 FL2 探测器检测 PI。 常见荧光素的特性： （1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490495nm，发射光：520530nm，明亮的 黄绿色荧光。 （2）RB200：橘红色粉末, 吸收光 5

8、70nm，发射光 595600nm，橘红色荧光。 （3）TRITC：紫红色粉末，吸收 550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。 （4）镧系：Eu、Tb （5）PE：吸收光 490560nm，发射光 595nm，红色荧光。 （6）其它：酶作用后产生荧光物质。 酶作用后产生荧光物质： 酶 底物 产物 激发光 发射光 B-G MUG MU 360 450 AP MUP MU 360 450 HRP HPA 二聚体 317 414 酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具 有强荧光的物质。例如，4-甲基伞酮-D 半乳糖苷受 -半乳糖苷酶的作用分 解成 4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为 360nm，发射光波长为 450nm。其他如碱性磷酸酶的底物 4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物 对羟基苯乙酸等。镧系螯合物 某些 3 价稀土镧系元素如铕 (Eu3+)、铽 (Tb3+) 等的螯合物可发射特征性的荧光，而且激发光波长范围宽、发射光波长范围窄、 荧光衰变时间长，最适合于时间分辨荧光免疫测定。 六、合适荧光素的选择：六、合适荧光素的选择： （1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。 （2）荧光效率高，标记后下降不明显。 （3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。 （4）标记后能保持生物学活性和免疫活性 （5）标记方法简单、快速。 （6）安全无毒