《哺乳动物组织基因组dna提取》由会员分享，可在线阅读，更多相关《哺乳动物组织基因组dna提取（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、本科学生实验报告本科学生实验报告姓名姓名 陈明辉陈明辉 学院学院 生命科学学院生命科学学院专业专业 生物科学生物科学 班级班级 08 级级 A 班班实验课程名称实验课程名称 分子生物学分子生物学指导教师及职称指导教师及职称 倪娟老师倪娟老师开课时间开课时间 2010 至至 2011 学年学年下下学期学期云南师范大学教务处编印1实验名称：哺乳动物组织基因组 DNA 提取 Genomic DNA Extraction from Mammal Tissue实验时间：2011-5- 24小组合作： 是 否一、实验预习1、实验目的：(1) 掌握动物基因组 DNA 提取的操作方法;(2) 掌握琼脂糖凝胶电
2、泳的操作的方法。Experimental Purpose：After the experiment is finished, students should be able to extract genomic DNA from mammal tissue, and to run an agarose gel. 2、实验设备及材料：Reagents and apparatus （1）Instruments：High speed refrigerated centrifuge（高速冷冻离心机） 、 Glass homogenizer（玻璃匀浆器） 、 Electrophoresis System
3、（电泳系统） 、 Ultraviolet transilluminator（紫外透射仪） 、Ultra cold storage freezer（超低温冰箱） 、Autoclave（高压灭菌锅） 、 Pipettes（微量加样器） 、Electronic balance（电子天平） 、Acidometer（酸度计） （2）Material：Liver of rabbite （3）Reagents：Tris、SDS、EDTA、 HCl、 NaOH 、 Sodium acetate (NaAc)、 Acetic acid (HAc)、 Phenol、Chloroform、Ethanol、Isoam
4、ylol、TE buffer 、Protease K、RNase A、Agarose、DNA molecular weight markers 、Boric acid、Sugar、Bromophenol blue、Fluorescent dye (Gelview)23、实验原理及实验流程或装置示意图：实验原理：（1）本实验利用去垢剂 SDS(十二烷基磺酸钠)是为了使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质从而 导致细胞裂解，而细胞裂解物又常用蛋白酶 K 进行水解处理。（2）随后用酚:氯仿进行抽提，以去除残留的蛋白质，这时蛋白质将进入有机相，或者假如 己变性的话将呈现在有机相与水相之间。乙醇沉淀处理则可以浓
5、缩 DNA，同时去除核苷酸、 氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。（3）为了进一步保护 DNA 样品的完整性，通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以 整合 Mg2+，这样将会减少脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因为该酶必须在有 Mg2+存在时才会 起作用。Experimental Principle:（1）The detergents SDS ( sodium dodecyl sulfate) is added to denature proteins and solubilize lipids in membranes leading to cell lysis . The ce
6、ll lysate is often treated with enzymes that hydrolyze RNA and proteins. （2）Then they are treated with phenol and chloroform to remove the remaining proteins, which will either enter the organic phase or, if they had denatured, appear at the interphase. Alcohol help to concentrate the DNA while remo
7、ving nucleotides, amino acids, oligonucleotides and peptides. （3）We can add the eathylene diamine tetraacetic acid (EDTA) to keep the integrity of DNA. EDTA can chelate Mg2+ and reduce deoxyribonuclease (DNase) activity, because these enzymes require Mg2+ to work.本实验方法分离得到的染色体 DNA 长度为 100-150kb，适用于构
8、建基因组文库和 Southern 杂交分析。如果要求得到较大分子量的 DNA，则必须省略其中的振荡步骤。试验流程 1、冰浴处理生理盐水 酶解液配制工作液 称取 0.2g 肝脏（冰冷的生理盐玻璃匀浆器 组织匀浆液 水清洗（3 次） ）剪碎 （2ml 匀浆液）玻璃匀浆器匀浆 移至 1.5ml 离心管 离心（4 5000rmin3060s ） 弃上清加 400ul 无菌水 吹散加 400ul 酶解液 水浴处理 （55、1218h） 2、酶解样品（加入 20ul 的 RNase） 待抽提的样品（等量分装在两支离心管内加 入等体积提取液(翻转混匀)） 配制 TE 缓冲液 抽提静置 离心（410000rm
9、in10min） 移出水相 至离心管抽提静置（等体积 提取液 500ul） 410000rmin 离心 10min 移出水相 加 1/10 NaAc 加 2 倍无水乙醇（-201-2h） 融化、12000rmin 离心 15min 离心 弃上清液 加 入 75%冷乙醇洗涤 12000rmin 离心 15min 离心 弃上清液 干燥 加 TE50ul 混匀DNA(4 存放) 3、(1)制备 0.3 琼脂糖凝胶。称取 0.06 g 琼脂糖，放人锥形瓶中，加入 20 mL 的 0.5TBE 缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为 0.3 琼脂糖凝胶液。 （由于蒸发作用， 溶解前在容量瓶上作一个记号，
10、溶解后用三蒸水补足） ；(2)制胶器的安装；(3)将熔化的琼脂糖凝胶液转入 Gelview 专用的三角瓶中，然后加入 Gelview 2l；(4)将冷到 60左右，缓缓倒入制胶器(注意不要形成气泡)；(5)待胶凝固后（80min） ，轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内；(6)加入电泳缓冲液(0.5)至电泳槽中。 4、通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图片。并将产物条带与已知分子量的标淮条带进行比 较，便可以对合适分子量大小的产物进行鉴定。 344、实验方法步骤及注意事项：核酸的分离纯化、测定及研究方法（1）分离核酸的一般原则因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构
11、是保证核酸结构与功能 研究的基础。1）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则： 保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。2）核酸的纯度要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取 DNA 分子时，应去除 RNA，反之亦然。3）核酸分离纯化的注意事项为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作 多在 pH410 条件下进行； 防止核
12、酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接 破坏核酸的一级结构。其中 DNA 酶需要金属二价阳离子 Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离 子螯合剂，如 EDTA 或柠檬酸盐等基本上可以抑制 DNA 酶的活性。RNA 酶不但分布广泛、 极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是 RNA 提取过程中的主要危 害因素； 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。 高温：如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合 键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为 04以降低核酸酶的活性从而减少对核 酸的生物降
13、解。机械剪切力：包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式 地破裂及 DNA 样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的 主要危害对象是大分子量的线性 DNA 分子，如真核细胞的染色体 DNA 等。（2）核酸分离纯化的一般步骤1）破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等 杂质纯化干燥溶解。2）核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器 中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两 方面质量均高的核酸分子。 试验方法步骤（1）储备液的制备5 molL
14、 NaCl，1 molL Tris HCl pH8.0，0.5 molL EDTA pH8.0，dddH2O， 3 molL NaAc pH5.2，生理盐水（0.85 NaCl） ，10SDS，5TBE，6凝胶加样缓冲液， 10mgmL 蛋白酶 K -20保存，10mgmL 无 DNA 酶的 RNA 酶 -20保存（2）破碎、酶解细胞（过夜）（3）抽提 DNA 、乙醇沉淀纯化 DNA（4）琼脂糖凝胶电泳检测 DNA（5）5TBE（电泳缓冲液 100mL5.4gTris，2.75g 硼酸， 2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)加蒸馏 水到 100mlpH8.0；0.25溴酚蓝：取 6
15、0ml 三蒸水，将 250mg 溴酚蓝溶解于其中 40(WV) 蔗糖水溶液：在上述溶液中加入 40g 蔗糖。5实验现象、数据及观察结果 实验现象 （1）随着电泳的开始，电泳槽内，出现水瀑布现象； （2）随着瀑布的形成，点样孔里面材料也慢慢在电极的作用下渗入到琼脂糖凝胶里面； （3）电泳后，在紫外灯下可以看到呈现出淡黄色的荧光物质； （4）酚抽提除去蛋白质时，试液分层：上层为水相，下层为酚相。2、对实验现象、数据及观察结果的分析与讨论：实验结果如图：(1) 实验结果中，有的条带是边缘较整齐，亮度明显，颜色较清晰的呈现长方形状，这是 DNA 提取较好的；而有的条带则是毛边状边缘，呈现不规则状 ，说明 DNA 提取的纯度不高;(2) 由图可见，对于实验结果即使是同一个组的产物的纯度都会有所不同。63、结论：（1）本次实验属于综合性实验，他需要我们在实验过程中明白所加入试剂的作用，进而加入 的量要控制好，各小组组员在剂量的添加时，互相合作就显得非常重要了； （2）分子生物学实验最大的问题之一就是操作过程中实验现象不明显，直到最后电泳结束在 紫外灯下才能看到，所以在前面操作时要特别小心每一个操作包括加的量，以及摇动的幅度等；（3）其实实验时对
