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1、实验 1 倾注平板法测定水中细菌菌落总数一、实验目的了解水中菌落总数测定的意义，原理；熟悉水样的采集与保存；掌握倾注 平板法测定水的菌落总数的技术方法，及正确进行结果的卫生评价。 2、实验原理样品中的微生物细胞充分分散开，使其均匀分布于平板中的培养基内。经 培养后，单个细胞及聚在一起的细胞可以生长繁殖，形成一个肉眼可见的菌落， 统计菌落数目，即可用以评价样品中的微生物的数量。水中细菌菌落总数是指 1ml 水样在营养琼脂培养基中，37经 24h 培养后 所生长的菌落数。用平板菌落计数测定水中细菌菌落总数，仅包括一群在营养 琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的和兼性厌氧的细菌菌落总数。 三、仪器与试剂营
2、养琼脂、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、灭菌平皿、放大镜、灭菌采样 瓶、灭菌刻度吸管、制备培养基用一般设备:量筒，三角烧瓶，pH 计或精密 pH 试纸等。四、实验方法 检验程序：操作步骤：1、检测细菌的水样采集与保存37 24h做成几个适当倍数的稀释液选择 23 个适宜稀释度，各以 1ml 分别加入灭菌平皿内，每个 浓度同时做 2 个平皿。同时做营 养琼脂空白对照。每皿加入适量营养琼脂菌落计数报告水样1）选择容量 500ml 的磨口带塞无色细口瓶，在采样前必须洗净，瓶口包扎 后灭菌备用。2）按无菌操作采集水样，采水量为瓶容量的 80左右，以便检验时充分 摇动，使菌胶团分散。3）在采集加氯消毒水样时
3、，采样瓶应在消毒前，按每 500ml 水样加入 1.5硫代硫酸钠溶液 2ml，以中和水中的余氯，终止氯的持续杀菌作用；然后， 121高压灭菌 20min 备用。4）水样采集后，应立即记录水样名称、时间、地点等项目，从速检验，一 般不应超过 2h，置冰箱保存时也不应超过 4h。2、水样的检测1) 用力振摇水样 2025 次，以分散可能存在的菌胶团。2) 以无菌操作法吸取 10ml 充分混匀的水样，注入盛有 90ml 灭菌水的玻璃 瓶中，混匀成 1:10 稀释液。3）吸取 1:10 稀释液 1ml 注入盛有 9ml 灭菌水试管中，混匀成 1:100 稀释 液，按同法依次稀释成 1:1000、1:1
4、0000 稀释液等备用。吸取不同浓度的稀释 液时，每次必须更换吸管。4）用 1ml 无菌吸管吸取 23 个适当浓度的稀释液 1ml，分别注入无菌平 皿中，每个稀释度同时做 2 个平皿，不同稀释度更换吸管。5）倾注约 15ml 己融化并冷却到 45左右的营养琼脂于上述平皿中，并立 即旋转平皿，使水样与琼脂充分混匀。每次检验时另用一个平皿只倾注营养琼 脂作空白对照。6）待平皿内琼脂冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置 37培养 24h。3、菌落计数在记下各平板上的菌落数后，应求出同一稀释度的平均菌落数，供计算时 使用。在求同一稀释度的平均数时，若其中一个平板有较大片状菌落生长时， 则不宜计数，应以
5、没有片状菌落生长的平板计数平均菌落数。若片状菌落不到 平板的一半，而另一半中菌落分布均匀，则可用计数一半平板上生长的菌落数 乘 2，代表整个平板上的菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。不同情况下的计算方法：1）首先选择平均菌落数在 30300 之间者进行计算，当只有一个稀释度的 平均菌落数符合此范围时，即以该平均菌落数乘以其稀释倍数报告。2）若有两个稀释度，其平均菌落数均在 30300 之间，则应按两者菌落总 数之比值来决定。若其比值小于 2，应报告菌落的平均数；若比值大于 2，应报 告其中较少的菌落。3）若所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应该按稀释度最高的平均菌 落数乘以稀释倍数报
6、告。4）若所有稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释度最低的平均菌落 数乘以稀释倍数报告。5）若所有稀释度的平均菌落数均不在 30300 之间，则应以最接近 300 或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数报告。报告方式：菌落数在 100 以内时，按实有数报告；大于 100 时，采用两位 有效数字乘以 10 的指数来表示在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法 计算在报告菌落数为“无法计数”时，应注明水样的稀释倍数。检验结果记录：稀释度10-110-210-3平板号121212菌落数平均菌落数菌落总数 五、结果意义 细菌菌落总数用以说明水被有机物污染的程度。我国生活饮用水卫生标准中规 定 lml 生活饮用水中，细菌菌落总数不得超过 100 个。 6、注意事项 1、实验开始前，应先将各稀释管、平皿做好标记，包括：稀释度、小组等。 2、进行水样的稀释时，吸管的更换：每支吸管吹打混匀本稀释度的水样，然后 吸取 1ml 水样注入到下一支无菌水管后（不要插入到无菌水中）即弃去，再用 新的吸管在下一稀释度重复上述操作。 3、倾注平板前注意琼脂的温度，不要太烫和太凉，否则使细菌烫伤和使琼脂凝 固。预先融化的琼脂可放入 45水浴保温。 4、37培养 24h 后，做平板计数时，可用肉眼观察，必要时可用放大镜检查， 以防遗漏。
