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1、掃描式探針顯微鏡於生物樣本的量測與應用掃描式探針顯微鏡於生物樣本的量測與應用吳靖宙 現為國立成功大學醫學工程研究所博士候選人 張憲彰* 日本國立東北大學化工博士，現為國立成功大學醫學工程研究所教授摘要摘要 顯微鏡的發明有助於人們對微小物體結構的觀察，傳統上常用來觀察生物 樣本分子級或細胞級結構的方法，大都採用電子顯微鏡法。在處理適合電子顯 微鏡觀測的樣本時，需經固定、切片、脫水、鍍金等等步驟，但一般生物樣本在正常生理狀況下是富含水份的，若經這些步驟，將會使生物樣本原本的形狀、 尺寸或結構產生變化，而所量得的影像將不再是生物樣本真正的形態。掃描式 探針顯微鏡(scanning probe mic
2、roscope, SPM)具有高解析率與在液相操作能力， 使生物樣本在正常生理環境下不需經前處理也能被觀測，此優點使 SPM 逐漸被 應用在生物樣本的量測上。特別是在此政府大力推行各項的奈米計畫(主要分奈 米電子、奈米材料、奈米生物、奈米檢測與設備開發 4 大主題)之際，SPM 其 簡便性與原子級解析力實為觀測奈米結構的利器，將在奈米生物領域之研究中 獨領風騷。本文將對 SPM 的基本原理、常用在生物樣本量測的功能與目前實際 在生物樣本之表面微觀或微小特定部位力學相關之量測時的應用，做一概述。一、一、緒論緒論 可藉以描述表面微結構之量測儀器的發展，關係到人類對生物樣本的認識 程度，早在 17
3、世紀虎克發明了第一台的光學顯微鏡(optical microscope)，觀察 到植物細胞的構造，並經過長久的光學發展，可以將生物樣本的結構看得更清楚。其後再藉助電腦與壓電掃描器製作技術的進步，更有共軛焦顯微鏡 (confocal microscope)的發明，大大提升了光學顯微鏡在軸上的解析度，且配 合螢光染色技術可對細胞膜上或胞內的分子做定性與定量上的量測，但其解析 度仍受到 Abbe 障礙(Ernst Abbe, 18401905, 解析度為觀測光源波長之半)的限 制只能達到 0.2 m。此光學的極限在 1934 年 Emst Ruska 發明了以電子束為光 源的電子顯微鏡才得以解決，並
4、得以擷取許多極微觀世界的資料與分子結構的 觀察。但這種必須以一次電子穿透(穿透式電子顯微鏡，TEM)或二次電子反射 (掃描式電子顯微鏡，SEM)的顯微技術，則須透過將試樣乾燥後鍍金甚至切片 的前處理後，置於真空中才能觀測，顯然這樣的試片製備程序在在會破壞生物 樣本的原有結構，而無法得到生物樣本在含水狀態下的真實特性。 到了 1980 年初期，掃描式穿隧電流顯微鏡 (scanning tunneling microscopy, STM)的發明則將顯微鏡的解析度提高到原子等級，其後更有利用原子間作用力 呈像的原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)被發明，由於 AF
5、M 具有可 在液相、氣相中操作且樣本不需複雜前處理的特性，被廣泛的應用在生物樣本 型態學的研究，且其力學量測的功能更被視為量測軟組織或分子間機械特性的利器。近年更有多種利用不同原理開發出來藉以評估樣本表面電性與磁性分布 的顯微鏡問世，這些利用探針掃描樣本表面的顯微鏡都統稱為掃描式探針顯微 鏡(scanning probe microscopy, SPM)。表 1 列出四種主要顯微鏡對表面量測的特 性比較。 表 1. 四種主要顯微鏡對表面量測的特性比較。Resolution X, YResolution ZCircumstancePretreatment requiredMagnificatio
6、nOptical Microscope0.2 m1mair, liquidnone103Confocal Microscope170 nm500 nmair, liquidnone104SEM2 nmN/Avacuumhard, drying, coating107AFM0.1 nm0.01 nmair, liquid, vacuumnone109二、二、發展歷史發展歷史 最早被發明的 SPM 儀器是 STM，其設計的概念早在 1979 年由 IBM 公司 的 Binnig 和 Rohrer 提出，並在 1982 年付之實現，其原理是利用探針與導體間 的穿隧電流來做呈像訊號，利用這儀器可在一般
7、空氣中得到原子級的解析度， 此發明亦打開了樣本表面原子排列研究之門，他們兩人也因為此貢獻得到了 1986 年的諾貝爾物理獎。由於 STM 應用的是穿隧電流，所以樣本必須是導體才能為功。其後為免除樣本僅止於導體的限制，1985 年 Binnig, Quate 和 Gerber 發明了 AFM，其原理是利用一極柔軟懸稈上探針與試片之間微小的原子 力 - van der Waals 力(約為數個 nN 左右)做呈像訊號，遂使非導體也可用掃描 式探針顯微鏡來觀測。此舉非但大大的減少樣本觀測前的處理，並可於液相中 直接觀測微觀的樣本，進而亦可用於生物樣本上的觀察(1)。此類的發明瓶頸大 開，之後更有利用
8、不同電性、磁性的探針以偵測樣本表面電力或磁性變化的 SPM 被開發，一再促進了 SPM 在表面量測上史無前例的應用性。 自 1990 年後電腦運算與控制技術的提升，SPM 更具有了原子操縱術、奈 米級的微影蝕刻術與奈米結構製作等功能，豪邁開闊了 SPM 應用的範圍。三、三、呈像原理呈像原理 SPM中被應用最廣泛的是原子力顯微鏡，許多其他功能的SPM儀器大都架 構在AFM原理之基礎上，以下就AFM的基本原理與呈像模式作一簡介。1. 基本原理基本原理根據Lennard-Jones pair-potential energy function的描述，原子之間的位能與 原子間距離呈現著如下的關係(1)
9、。 )()(4)(612 rrrEpair: the diameter of the atoms, r: distance between two atoms : permittivity 其兩原子間的距離與位能的關係圖如圖1所示，利用原子間的吸引力與排斥 力的作用，可得三種基本的操作模式(2, 3)。 (1)利用原子斥力的變化而產生表面輪廓的稱為接觸式(contact mode)，探針與試 片的距離約為數個，其能量的大小主要與原子間距倒數的十二次方成正比。(2)利用原子吸引力的變化而產生表面輪廓的稱為非接觸式(noncontact mode)， 探針與試片的距離約為數十個到數百個，其吸引力的
10、大小主要與原子間距 倒數的六次方成正比。 (3)若使懸桿產生上下擺動輕拍於樣本表面，並藉由振幅的改變而呈像的稱為 tapping mode，由於受到吸力與斥力的交互作用，也稱為intermittent-contact mode或semi-contact mode。Non-contactIntermittent-contactContactatomExpulsive forceAttractive forceatomatomatom圖1 兩原子間的距離與相對位能的關係圖。凡得瓦力隨兩原子之間的距離而改 變，當兩原子的電子雲互相接觸時會產生排斥力，當距離拉遠時，會因彼 此的電子與原子核相吸而產生吸
11、引力。其不同操作模式下探針掃描樣本表面的示意圖如圖2所示。Contact modeTapping ModeNon-contact mode5100 nm25 nmA few nm圖2 原子力顯微鏡操作模式示意圖。 2. 系統架構系統架構 接觸式原子力顯微鏡的呈像原理如圖 3 所示，我們可將系統區分成三個部分；(1)原子間作用力感測器-懸桿(cantilever)，感測懸桿尖端的原子與相對應在 樣本表面原子之間的作用力; (2)懸桿偏移量感測器，主要由光學式雷射對焦系 統與位移敏感的感光二極體(position sensitive photo-diode, PSPD)組成；(3)位移 掃描系統，
12、由回饋線路與壓電晶體掃描器(piezoelectric scanner)所組成。 在 SPM 的操作中，起先調整雷射光使之聚焦在懸桿的背面，然後調整 PSPD 的位置使反射光點投射至 PSPD 的中心，當開始掃描後，懸桿會因尖端的 原子與樣本間所產生的原子作用力(排斥力或吸附力)，隨著輪廓的改變而上下 移動，使反射的雷射光束改變其角度，並藉由 PSPD 感測雷射光束的偏移量。 經 PSPD 傳遞變動的訊號至掃描器，掃描器為一壓電晶體的裝置，藉由施加的 電壓訊號回饋壓電晶體的位移，使懸桿的施力維持固定，系統並利用此電壓訊 號呈像。 PSPDPiezoelectric scannerSampleT
13、opographyLaser CantileverXZYFeedback systemImage圖 3 原子力式顯微鏡呈像架構示意圖。在架構上依掃描器與懸桿附著的位置，可分為底置式(如圖3)與懸吊式 (suspension model) (如圖4)，在底置式設計中，懸桿量測部分與掃描器是分開的， 具有較高的儀器穩定性，可做到原子級的量測，但由於樣本需置放在掃描器上， 所以樣本有重量與大小的限制。懸吊式則將量測用的懸桿附著於掃描器，由掃 描器帶著懸桿進行掃描的動作，使量測雜訊較底置式的大，但樣本是置放在載 台上，適合大樣本或液相中的量測。Sample TopographyLaser Cantil
14、everFeedback systemImagePSPDPiezoelectric scanner圖 4 原子力顯微鏡懸吊式的架構圖。四、四、SPM 常用在生物樣本上的功能常用在生物樣本上的功能 1. 表面輪廓的量測表面輪廓的量測 (1)定力模式 (constant force mode) 也就是使探針與樣本表面的作用力維持恆定的模式。其架構如圖 4 所示， 當開始掃描時，懸桿會因樣本表面輪廓的改變而產生偏移，使反射雷射光束改 變在 PSPD 上的位置，之後經 PSPD 與回饋系統傳遞變動的訊號至掃描器，使 掃描器利用延展與縮回的動作，維持探針與樣本間作用力恆定，利用此回饋訊 號呈像的圖稱為
15、topography。此模式適合具有較粗糙表面樣本的觀測。 (2)定高模式 (constant height mode) 其架構如圖 5 所示。使掃描器主要做 X、Y 軸的移動而不做 Z 軸的回饋運動，此時探針會以固定的高度掃描樣本，懸桿會因樣本的高低起伏產生不同的 偏移量，使反射雷射光點在 PSPD 上的訊號與設定點(set point)之間產生差異值， 利用此訊號而得的影像稱為 error signal image (Park Scientific Instruments Corp., PSI)或 force image (NT-MDT )等。由於掃描器沒有 Z 軸上的運動，所以量測系 統
16、的穩定度較定力模式好，較適合進行需高解析度或平滑樣本表面的微小變化 觀測。ScannerSet pointDeflection .SampleForce image_圖 5 SPM 定高模式於表面輪廓量測的架構圖。 2. 力學特性的量測力學特性的量測 (1)定性分析 (i)側向力顯微術 (lateral force microscopy, LFM)當探針的尖端掃描樣本表面時，樣本表面的摩擦係數或樣本高度改變時， 會使探針做左右方向的擺動，利用四象限的 PSPD 追蹤與紀錄，可測得反射光 束在 PSPD 上的左右偏移量。此模式可應用於樣品結構成份區分，表面潤滑特 性分析，表面摩擦力量測等等。量測模式如圖 6 所示。(4)(i)(ii)(iv)(v)(iii)LFM (iv)圖 6 LFM 呈像原理示意圖。(ii)力調變顯微術 (force modulation microscopy, FMM) 如圖 7 所示，SPM 在 contact mode 的操作模式下，施加一 AC 訊號至掃描 器，使掃描器產生一小的振盪，再量
