植物基因工程考试总结

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1、1、名词解释部分GFP：绿色荧光蛋白基因,利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将 GFP 作为蛋白质标签。 SiRNA：是一种小 RNA 分子（21-25 核苷酸） ，由 Dicer（RNAase 家族中对双链 RNA 具有特异性的 酶）加工而成。SiRNA 是 siRISC 的主要成员，激发与之互补的目标 mRNA 的沉默。 MAR 或或 SAR：指被限制性内切酶消化后仍与核骨架结合的 DNA 序列，位于染色体的端粒附近，长度一 般为 30bp-1000bp，通常富含 AT，两个 MAR 之间的染色质区域可形成大小为 5kb-200kb 的 DNA 环，构 成独立的表达结构。MAR 通过对染色

2、质结构的直接限制而起作用，使转基因不能形成稳定的凝聚染色质 结构，保证了转录的正常进行，使 RNA 酶聚合酶容易接近这种结构，从而提高了转基因的表达效率。 BIBAC：双元细菌人工染色体,使大片段外源 DNA 稳定整合到宿主细胞基因组中。 LHCP a/b or Cab：光诱导型启动子,在叶中具有叶绿体依赖的光诱导增强特性,在在根中具有组织特异的沉 默子功能. RNA interference (RNAi)：RNA 干扰,与靶基因同源的双链 RNA 诱导的特异转录后基因沉默现象，使用 RNAi 技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达。 Dicer 酶：酶：是 RNA 酶家族的一个成员。Dice

3、r 酶参与 RNAi 反应，广泛存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物 及哺乳动物。 RdRP：RNA 合成的聚合酶，在 RdRP 的作用下，进入细胞内的双链 RNA 通过类似于 PCR 的反应过程， 呈指数级的数量扩增。 CAT：氯霉素乙酰转移酶基因，一种报告基因，是第 1 个用于检测细胞内转录活性的报告基因。 IPCR：反向 PCR，它的目的在于扩增一段已知序列旁侧的 DNA。反向 PCR 可用于研究与已知 DNA 区 段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。 RDA： RT-PCR：逆转录 PCR,是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR 中，一条 R

4、NA 链被 逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。 GUS：-葡萄糖苷酸酶基因,其反应产物可用多种方法检测出来。因此这个基因被广泛应用于基因调控的 研究中。 SSH：抑制性消减杂交，是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术，其原理是以抑制性多聚酶 链反应(PCR)反应为基础的 cDNA 消减杂交技术。 DDRT：传统 mRNA 差异显示技术，根据绝大多数真核细胞 mRNA 3端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结 构，因此可用含 dT 的寡聚核苷酸为引物将不同的 mRNA 反转录成 cDNA。将差别表达条带中的 DNA 回 收，扩增至所需含量，进行 Sout

5、hernblot 或 Northernblot 或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最 终获得差异表达的目的基因。 RAD：代表性差示分析，充分发挥了 PCR 以指数形式扩增双链模板，而以线性形式扩增单链模板的特性， 通过消减和富集，使得目的基因片段得到特异性扩增。 RdRP：RNA 为模板指导 RNA 合成的聚合酶,在 RdRP 的作用下，进入细胞内的双链 RNA 通过类似于 PCR 的反应过程，呈指数级的数量扩增。 T-DNA 标签：标签：以 T-DNA 为标签，通过农杆菌转化植物，构建突变体库，获得大量具表型的突变体，根 据插入片段和插入点的基因组序列和突变性状进行分离检测。是一种高

6、通量的分离和克隆植物功能基因 的方法。NPT：编码新霉素磷酸转移酶,能赋予细胞抗卡那霉素的能力，这是核基因转化中常用的一种筛选标记。2、简答部分1）筛选标记基因与报告基因的比较：）筛选标记基因与报告基因的比较： 筛选标记基因（筛选标记基因（Selective Marker genes）：）：它的基因产物能给予植物细胞产生一种抗选择压力，在选择剂 存在时，转化细胞生长、发育、分化基本不受影响，而没有转化的细胞不能正常生长。报告基因（报告基因（reporter genes）：）：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物非常容易被鉴定。 把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或

7、与其它目的基因相融合，在调控序列控制 下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。它的基因产物能使 植物细胞带上一种标记，起报告和识别作用。 报告基因，必须具备几个条件： (1)已被克隆和全序列已测定； (2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物； (3)其表达产物能进行定量测定。 2）一元载体和二元载体系统的比较：）一元载体和二元载体系统的比较：双元载体（双元载体（binary vecter）系统）系统是指由两个分别含TDNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统, 又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上

8、，通过反式激活T-DNA转移,故称之为反式载体（trans vecter）. （1）一元载体系统由两个质粒重组而成，分子量大，需要整合；二元载体不需要整合过程， （2）Mini T-DNA具有大肠杆菌复制位子，可在大肠杆菌内复制，拷贝数高，10-100倍，本身小，便于操 作。 （3）一元载体构建时操作比较困难；二元载体系统操作简单。 （4）Mini-Ti质粒小，所以进入农杆菌容易，转化率高。 （5）一元载体构建好后，稳定性好；二元载体稳定性差，易丢失。 （6）二元载体系统工作效率高，转化效率高。 3）基因图谱与物理图谱的比较：）基因图谱与物理图谱的比较： 基因图谱（基因图谱（genetic m

9、ap）：）：用以表示基因在一个DNA分子(染色体或质粒)上相对位置、连锁关系或物理 组成(序列)的图示。 物理图谱：物理图谱：是把Ti质粒，用限制性内切酶处理以后，经琼脂糖凝胶电泳作片段分离，就能得出有20多条大 小不同的DNA酶切片段。然后这些片段进行比较分析、测定顺序，再排列成完整的物理图，也即不同酶 切片段的相对位置。物理图谱是制作Ti质粒基因图的基础。 4）顺式作用元件与反式作用因子：）顺式作用元件与反式作用因子： 顺式作用元件：顺式作用元件：是指与结构基因串联的特定 DNA 序列，是转录因子的结合位点，它们通过与转录因子结 合而调控基因转录的精确起始和转录效率。主要组成：启动子，增强

10、子，沉默子 反式作用因子：反式作用因子：指由不同的染色体上基因编码的、直接或间接识别或结合各种顺式作用元件并参与调控 基因转录效率的结合蛋白。也称为转录因子。反式作用因子有两个重要的功能结构域:DNA 结合结构域和 转录活化结构域,它们是其发挥转录调控功能的必需结构。 顺式作用元件（cis-actingelement）存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，它们的作用是参与基 因表达的调控，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。 转录因子的作用机制有 3 种：转录因子结合 RNA 聚合酶 II 形成起始复合物，并与启动子的 TATA 框元 件结合启动转

11、录过程；转录因子可以使 DNA 形成环状，将远处的顺式作用元件拉到起始部位；多个转录 因子的组合效应决定了转录起始的速率。 5）启动子：）启动子：确保转录精确而有效地起始的 DNA 序列，主要包括：TATA box 25-35 （负责转录起始的 精确性） ，CAAT box 和 GC box 80-110 ( 控制转录起始频率） 增强子：增强子：增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或 下游)上都发挥作用。其功能是通过结合特定的转录因子或影响 DNA 的构象而实现的。增强子作用的三 个特点：1.它与启动子的相对位置和取向无关，具有远程效应 2.需要特

12、定的蛋白质因子的参与 3.有些（如 SV40 的增强子)能在几乎所有类型细胞中发挥 作用，而大多数具有相对的组织特异性 增强子和启动子均为表达调控的瞬时作用元件，启动子是转录起始位点上游与 RNA 聚合酶结合的一段 DNA 序列，增强子是通过启动子来增加转录的，他的位置不固定可以在启动子下游或上游。6）酵母双杂交系统）酵母双杂交系统：是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如 GAL4等)的 DNA 结合结构域基因和 GAL4 激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。Ac-Ds 双系统法：双系统法：该方法利用 Ds 转座子在 Ac

13、转座子的编码的转位酶作用下插入到某个基因中导致其功能失活，得到稳定的形态变异植株后，用 IPCR 方法扩增与 Ds 相邻的植物 DNA 片段并用之扩增相应的基因。酵母双杂交系统可以根据兴趣蛋白的基因序列即可筛选与其作用的目的蛋白，也可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。还可以检测两种蛋白质的瞬时作用。Ac-Ds 系统则可以根据表型的突变来寻找相应的目的基因，不需要知道目标基因结构信息。7）基因组文库）基因组文库：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组 DNA，可以得到大量的基因组 DNA 片段并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组

14、DNA 片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。CDNA 文库：文库：以 mRNA 为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成 cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段 cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部 mRNA信息的 cDNA 克隆集合称为该组织细胞的 cDNA 文库。cDNA 文库具有组织细胞特异性，cDNA 文库显然比基因组 DNA 文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。对真核细胞来说，从基因组 DNA 文库获得的基因与从 cDNA 文库获得的不同，基因组文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从 cDN

15、A 文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的 cDNA。 3、论述题： 1、植物原生质体转化系统的方法，优缺点和局限性。 2、外源基因在转基因植物细胞内的表达调控 3、根据功能蛋白分离目的基因的技术路线、根据功能蛋白分离目的基因的技术路线 步骤： 一、分离纯化功能蛋白 1首先从组织或细胞中把蛋白质溶解出来,与杂蛋白分离后根据蛋白质的分子量大小、溶解度、电荷、吸 附性质、对配体分子的生物学亲和力等进一步分离纯化。方法有透析、密度梯度离心、凝胶过滤、等电 点沉淀、盐溶盐析、等电聚焦电泳（IEF） 、SDSPAGF、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等。 二、氨基酸序列分析 策略为：1测定多肽链的数目

16、 2多肽链、或亚基的拆分 3肽链氨基酸组分测定 4多肽链的部分断裂（化学降解法、酶裂解法）和肽段的分离 5肽段氨基酸序列测定（化学降解法、酶解法、质谱法、氨基酸自动测序仪测序法） 6肽段在多肽中次序的决定 一般用两种以上方法断裂多肽，做成两套或几套肽段，这两套或几套肽段的切口是彼此错位的 7二硫键位置的确定 三、基因分离 方法有： 根据已知氨基酸序列设计简并性引物从植物基因组中克隆出目的基因根据氨基酸序列设计 寡聚核苷酸探针筛选基因组或文库 免疫学法筛选表达文库 根据已纯化蛋白制备相应的抗体构建表达型基因文库或文库 利用抗体筛选表达文库找出阳性克隆 4、根据、根据mRNA分离目的基因分离目的基因 1 mRNA differential display PCR （ DDRT PCR ）：mRNA 差式显示 原理：通过反转录与PCR扩增mRNA中特定的一小部分。用DNA序列分析胶同步分离显示扩增产物以 进行比较。首先以3端锚定引物（5-TMN- 其中T为10-20个，M为