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1、同步培养同步培养指使细胞的分裂周期为同步的培养方法。同步化方法的原理是在使所有细胞都处于大体相同的分裂周期的处理后，才使增殖同时开始进行。最稳妥的操作 方法是对细胞的大小等先作出一个标准，将大体同一时期的细胞选出并集中起来。另外， 是采用从培养基中除去生长发育所必需的营养源、温度处理、或加药剂等方法，抑制先 发育的细胞的发育，待到晚发育的细胞发育以后，解除上述处理，使增殖再一齐开始。在一般培养条件下，群体中的细胞处于不同的细胞周期时相之中。为了研究某 一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，常需采取一些方法使细胞处于细 胞周期的同一时相，这就是细胞同步化技术。选用 DNA 合成抑制剂可逆地抑
2、制 S 期细胞 DNA 合成而不影响其他细胞周期运转，最终可将细胞群体阻断在 G1S 期交界处；一些抑制微管聚合的药物，因抑制有丝分裂装置的形成和功 能行使，可将细胞阻断在有丝分裂中期，即使细胞同步于 M 期。细胞同步化实 际包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的 两层含义。常用的人工同步化法分为诱导同步化,选择同步化或两者结合. 1):诱导同步化法: a.胸腺嘧啶阻断技术,先高浓度胸腺嘧啶培养细胞，使细胞不能通过 S 期,再改变其浓度，解 除抑制,所有细胞都开始 DNA 合成，即获得同步化细胞. b.中期阻断法,常用秋水仙素来抑制微管聚合,将细胞阻断在有丝分裂中期
3、.此法不常用. 2)选择同步化法: a 有丝分裂选择法,这种方法主要是根据细胞周期的不同阶段的生理变化设计的方法.主要特 点是可以获得一定数量的 M 期的同步化细胞，不受药物影响,同步化高，但获得细胞数量 少，步骤多，且只能是在贴壁细胞中可以用. b 细胞沉降分离法,主要用于悬浮细胞，其理论依据是细胞周期不同阶段的细胞体积不同.因 为细胞在某一离心力场中的沉降速度与其半径的平方成正比.(一)M 期同步化方法 1振荡收集法 该法利用 M 期细胞变圆易脱落的特点，将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间隔振荡，使 M 期细胞脱落，逐步收集培养基，并补充新的培养基。收集的细胞放 4E 冰箱中保存，离 心沉
4、淀后即获得 M 期细胞。 2秋水仙胺阻抑法 (1)将细胞传代培养至指数生长期。 (2)加入秋水仙胺，使最终浓度为 00501gmL 培养基，作用 67 h。如使用秋水 仙素，使用浓度应加大 510 倍。 (3)荡收集细胞，800 rmin 离心 510 min，弃上清，收集的沉淀细胞即为 M 期细胞。 加入一定量培养基将细胞接种到培养瓶中或直接进行离体实验。由于秋水仙素或秋水仙胺 对细胞有一定毒性，用量较小或作用时间较短细胞活性尚可恢复，而用量过大或时间过长 则细胞不能存活，因此使用时应严格控制其剂量和作用时间。3N2阻断法 此方法较秋水仙胺阻抑法好。 (1)将细胞传代培养至指数生长期。(2)
5、将培养瓶置于 N20 罐中通人适量 CO2(约相当于罐中体积的 5)。 (3)关闭好 N2罐，接上 N2管子及压力表，缓缓向罐中充气一直到压力为 80-90 磅英寸 2 为止。 (4)将 N2装置放在 37培养箱中 1016 h(通常过夜)。次日从培养箱中取出，然后缓缓将 N2放出(最好放出窗外)。 (5)取出细胞在镜下观察同步化效果，用振荡法收集细胞于离心管中。 (6)800 rmin 离心 10 min 收集细胞。(二)S 期同步化方法 胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法：该法利用过量 TdR 能阻碍 DNA 合成的原理而设计，为了 加强细胞同步化效果，常采用两次 TdR 阻断法，即双阻断法。
6、第 1 次阻断时间相当于 G2、M 和 G1期时间的总和或稍长，释放时间不短于 S 期时间，而小于 G2+M+G1期时间，这样 才能使所有位于 G1S 期的细胞通过 S 期，而又不使沿周期前进最快的细胞进入下一个 S 期。第 2 次阻断时间同第 1 次，再释放。现以 HeLa 细胞为例加以说明(HeLa 细胞周期时间 为 21 h，其中 G1期为 10 h，S 期为 7 h，G2期为 3 h，M 期为 1 h)。 1将细胞培养至指数生长期的早期。 2加入含 2 mmolL TdR 的培养基(225 mmolL 用于肿瘤细胞的同步化培养，而 CHO 细胞则用 7 mmolL TdR)，作用 16
7、 h。 3弃掉 TdR 培养基，用 Hanks 液洗 23 次，再换上新鲜培养基继续温浴 9 h。 4重新加入 TdR 培养基(浓度同上)进行第 2 次阻断，作用 16 h。 5再弃掉 TdR 培养基，Hanks 液洗 23 次后换上普通培养基。第 2 次 TdR 释放 0 h 时取 样则细胞处于 G1S 期交界处；如 2-7 h 取样则为不同阶段的 S 期细胞。 注意：具体 TdR 作用和释放的时间应参考每一种待同步化细胞的细胞周期各时相测定的参考值，也可根据 经验确定。(三)G1期和 G2期细胞的获得 1G2期细胞的获得 根据细胞周期测定的数值，采用 TdR 双阻断法使细胞同步在 G1S
8、期 交界处后，洗去 TdR 使细胞释放后继续培养。其培养时间应大于 S 期时间而小于 S+G2期时 间。然后先用振荡法使已进入 M 期的细胞脱落，弃去上清培养基；再用胰酶消化，加入新 鲜培养基制成细胞悬液，离心收集细胞，即为 G2期细胞。 2G1期细胞的获得(1)将用 M 期阻断法获得的细胞加入一定量的培养基，继续培养 110 h 即可获得各阶段的 G1期细胞。 (2)用缺乏异亮氨酸的培养基培养细胞，培养时间超过一个细胞周期，即可获得中 G1期细 胞。 (四)G0期细胞的获得 可采用血清饥饿法得到 G0期细胞：1取处于对数生长期的细胞。 2用含 05 - 1小牛血清的培养基培养细胞 4872
9、h。或用无血清的培养基培养 24 h。 3用 01 - 025胰蛋白酶消化细胞可收获 G0期细胞，可用H-TdR 掺人进行测量 鉴定。 (五)同步化细胞的检测 对各个时期的同步化细胞可通过流式细胞术来鉴定其细胞周期，通 过比较各时相细胞的百分比，看是否达到预期的目的。S 期细胞可通过放射自显影来鉴定 结果(图 232)，M 期细胞可涂片、染色，在显微镜下观察染色体，计有丝分裂指数(图 233)。(六)为了提高同步化效率，也可将几种同步化方法结合使用。如用 N2阻断法进行 M 期细胞 同步时，可先将对数生长期细胞用 25 mmoLL TdR 处理一段时间，更换新鲜培养基并释 放一段时间后，装入笑气罐中，这样处理可进一步提高 M 期细胞同步率。
