《种传番茄溃疡病菌直接PCR和免疫捕捉PCR检测方法之比较》由会员分享，可在线阅读，更多相关《种传番茄溃疡病菌直接PCR和免疫捕捉PCR检测方法之比较（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2010年第4期 植物检疫4 种传番茄溃疡病菌直接捉现华 ，韩跃武 ，刘箐 ，王军平 ，刘雅莉 ，文朝慧 ，刘姝彤 ，宋蕤 ，施颖波 (1兰州大学基础医学院医学生物化学与分子生物学研究所甘肃兰州730000；2甘肃出入境检验检疫局； 3兰州大学生命科学院细胞生物学研究所；4甘肃农业大学食品科学与工程学院) of by 130000， 0一BS，as CR as by CR to a in he CR 0 mL in 0 mL in s a CR mL in 0 mL in he 00一CR in be of CR；要用以梯度纯菌液和带菌种 子提取液作为模板进行直接较2种方法在纯菌液和带菌种子提
2、取液中的检测灵 敏度，找到一种高特异性、高灵敏度、简便快捷的方法用于检测番茄种子携带的番茄溃疡病菌。结果显示 在纯菌液中直接疫捕捉带菌种子提取液中直接度为10 疫捕捉疫捕捉其在实际种 子检测中优势更明显，而且检出时间短，重复性好。 关键词番茄溃疡病；番茄种子；直接疫捕捉图分类号32，$4131 番茄溃疡病是一种严重的细菌性病害，在北 造成了极大的经济损失 。其病原为密执安棒形 京、黑龙江、辽宁、内蒙古，新疆、河北、山西、山东、 杆菌密执安亚种(上海、海南等地都有发生，给主要商业番茄生产区 该病菌已被欧洲和地中海植物保护 基金项目：甘肃省科技厅中小企业创新基金计划(项目编号：0802国家质监总局
3、项目(项目编号：2007 009通讯作者：E稿日期：20100208，2010一4修回 12 2010年第4期 植物检疫织(为 也是我国进境检疫性有害生物。种子带菌是造成 大规模流行的最主要途径，存在于种子中的病菌能 生存数月甚至12年_3 J。甘肃省河西地区外繁种 子基地因其光照充足、自然隔离条件好等优势，成 为中国乃至世界农作物制种的重要基地之一，其中 番茄制种面积占全国总制种面积的1020，近 年在制种基地屡次暴发的番茄溃疡病，威胁种子基 地的健康发展，给当地农民和制种公司带来巨大的 经济损失H 。因此，建立高特异性，高灵敏度、简 便快捷的番茄种子检测方法是控制番茄溃疡病暴 发的最重要的
4、措施。 目前番茄溃疡病菌的检测方法主要包括免疫 学如 J、免疫荧光。 和分子生物学方法如普 通荧光j。但这些方法都存在缺 点，如常有交叉反 应；普通荧光茄种子的带菌率只有 15，普通的检测方法很难检测出来，甘肃出 入境检验检疫局国家级外繁种子检疫重点实验室 经过长期的种子检疫实践建立了灵敏度高、快速准 确的，能直接对带菌种子进行检测的免疫捕捉术。该技术集合了免疫学富集和的优势，省去核酸提取的过程，降低操作过程中 病原损失，极大地提高了检测的准确性和灵敏度， 缩短了检测周期，是一种特别适合于种子中微量病 原的检测方法。 1材料与方法 11材料 111标准菌株和抗体 番茄溃疡病菌株购自英国国家植物
5、致病性菌 种保藏中心(979)；番茄种子为本实验室 保存；番茄溃疡病菌多克隆抗体购于德国司(商品目录号07063)。 112试剂和引物 报道的针对163S ，序歹0为 一：5 一引物由上海生工合成； 12方法 121梯度菌液和模拟带菌种子提取液的制备 将标准菌株充分溶解后在固体培养基上划板， 28培养72后在523液体 培养基中28恒温振荡培养1215h，此时菌液 为025(细菌约为10 。取此 菌液依次10倍稀释到后进行平 板计数，梯度菌液计数结果为2410 一24 10 50250过夜静置后，用纯菌 液依次10倍稀释到病原提取液中，制备出模拟带 菌种子提取液，浓度为2410 24 10 1
6、22纯菌液及带菌种子提取液直接浓度为2410 2410 和模拟带菌种子提取液各5 于 入316 去离子水，参照2等人的方法在 裂解10后放置冰上片刻，冷 却后加入1341括10 5m )41L、酶(5UL)04反向引物(5)各 2 L，扩增条件为94C 2430s，625s， 7245s，35个循环；727 存。取 琼脂糖凝胶电泳，为051xg统下分析并照相。 123 纯菌液及模拟带菌种子提取液免疫捕 捉番茄溃疡病菌特异性抗体用碳酸盐缓冲液 (6)稀释至251xg501中37过夜。取出后倒掉包被液 用5涤4次，吹干 后，取不同梯度纯菌液和带菌种子提取液各50 于包被过抗体的7 夜，期间可轻柔振荡，然后弃去菌液，用次，在 9裂解 10 L 余方法同 上。以上所有实验均重复3次。 2结果与分析 21纯菌液直接同梯度纯菌液检测结果表明，在亚种特异性 引物扩增后，直接、3、 4号泳道显示有270余泳道未见 目的片段(图1)，说明直接0 疫捕捉、3、4、5、6号泳道 一010年第4期 植物检疫显示有2702)，说明免疫捕捉 直接
