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1、体内实验研究 的常见问题及解答问：进行体内研究前需要注意什么？答：为体内研究设计的实验需要考虑：动物模型的选择、给药途径、剂量以及重复给药的频率。选择siRNA 的用量和浓度时应该考虑以下因素：靶器官的特性和研究物的大小。问：进行小鼠的体内研究需要多少量的 siRNA？答：siRNA 体内研究领域相对较新，很少有已经确定的实验程序，因而很难确切地说实验需要多少量的siRNA。我们推荐您通过文献检索参考其他类似的体内研究需要的 siRNA 的量。小鼠全身给药需要 100uL浓度为 10500uM 的 siRNA。有研究表明在大剂量给药时，一些毒性在 20 mg/kg/day (416 mM)以上
2、才能观测到。问：锐博合成的 siRNA 能用于体内研究吗？答：我们已经对合成的 siRNA 进行处理，使其能应用于动物研究。问：在体内研究中，最好的给药途径是什么？答：寡核苷酸可以通过大剂量给药或使用 ALZET 微小泵持续给药。大剂量给药时要慎重，因为已有研究表明：一些毒性与寡核苷酸反义链的浓度有关，快速给药时可能会导致动物下肢瘫痪或致死，所以给药时要注意观察。很多已发表的论文实验是通过尾静脉给药的。任何给药方式都需要优化，以确保最佳的导入方式和动物的健康。剂量/浓度计算 的常见问题及解答问：定量 RNA 的公式是什么？答：研究者可以用 Beer 法则定量 RNA：吸光度（260nm）=(摩
3、尔消光系数)*(浓度)*(路径长度,cm)。为了便于理解，等式变为：浓度（吸光度,260nm）/(摩尔消光系数)*(路径长度,cm)。当使用一个标准的10mm 比色皿时，在公式中路径长度这个变量等于 1。问：我需要浓度为 20uM 的样品，如何计算重悬 siRNA 缓冲液的量？答：锐博为您提供的 siRNA 是 nmol 数量级的冻干粉。样品浓度的计算如下：（siRNA 的量，nmol）/（重悬体积，uL）样品浓度，umol/L。在解答前应先统一单位，确保单位可以抵消。例如：您购买了20nmol 的 siRNA，想溶解为 50uM 的样品。可按以下方法计算重悬缓冲液体积：a. 等式: (20
4、nmol)/ ? uL = 50 umol/L；b. 解答未知量: ? uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)；c. 单位换算: ? uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)(1 umol/1,000 nmol)(1,000,000 uL/1 L)；d.答案: ? uL = 400 uL。因此，应该使用 400uL 缓冲液去重悬 20nmol的 siRNA，溶解后为 50uM 的样品。问：6uL 浓度为 10uM 的 siRNA 溶解液中含有多少 ug 的 siRNA？答：首先计算含有多少 nmol 的 siRNA： a. 等式: ? nmol = (6 uL)(
5、10 umol/L)；b. 单位换算: ? nmol = (6 uL)(10 umol/L)(1 L/1,000,000 uL)(1,000 nmol/umol)；c. 答案: ? nmol = 0.06 nmol。然后利用 siRNA 的平均分子量（13,300 g/mol）把 nmol 变为 ug：a. 等式: ? ug = (0.06 nmol)(13,300 g/mol)；b. 单位换算: ? ug = (0.06nmol)(13,300 g/mol)(1mol/1,000,000,000 nmol)(1,000,000ug/g)；c. 答案: ? ug = 0.7980.8 ug。所
6、以 6uL浓度为 10uM 的 siRNA 溶解液中含有 0.8ug 的 siRNA。问：siRNA 的贮存浓度和工作浓度有何区别？答：siRNA 的贮存浓度就是保存的最佳浓度，锐博推荐的贮存液浓度为 20 M；而 siRNA 的工作浓度就是使 siRNA 能够达到最佳沉默效果的转染浓度，一般 10100 nM 范围内，锐博生物推荐的转染浓度是50nM。共有 4 条记录 共有 1 页 当前第 1 页 尾页 跳转到1处理与保存方法 的常见问题及解答问：你们提供的 siRNA 是怎样装运的？如果在常温下放置了一个星期，还有效吗？答：锐博为您提供的 siRNA 是冻干粉包装的，在常温下运输。这些冻干
7、的样品在室温下能稳定保存 24个星期，所以放置一个星期不会影响其沉默效果。但我们建议您收到样品后最好保存于-20或-70有霜冷冻箱中。问：在脱保护实验中，是否需要将样品加热到 90？答：在进行 RNA 寡核苷酸单链的脱保护实验时，通常在 90下加热样品几分钟就能保证在分子生物学水平改变潜在的二级结构。我们推荐您在 55-60下加热样品 5 分钟更有利于二级结构的改变。在 90下加热也能达到同样的效果，但超过一定时间核苷酸链就可能被降解。问：重悬后是否需要退火？答：重悬后在一般情况下不需要退火。如果需要，我们推荐您在 55-60下加热样品 5 分钟，然后脉冲离心，在室温下静置 30 分钟冷却即可
8、。问：siRNA 样品应该如何保存？答：无论是以冻干粉保存还是重悬于无 RNA 酶的缓冲液中， siRNA 都应该保存于-20或-70的有霜冷冻箱中。PH 为 7.47.6 的缓冲液有利于 siRNA 在冻结溶化的循环中保持稳定。我们推荐 siRNA 重悬于20-100mM 的浓度且存储在小容器中。siRNA 的冻溶次数应控制在 5 次以内，避免反复冻溶。在这些条件下存储并使用无 RNA 酶技术，siRNA 能稳定保存六个月或更长时间。考虑到 siRNA 会被降解，可利用PAGE 胶对其完整性进行分析。共有 7 条记录 共有 2 页 当前第 1 页 尾页 跳转到1siRNA 的基因沉默效果评估
9、 的常见问题及解答问：沉默效果不理想，应该如何处理？答：最常见的影响沉默效果的两个原因是：转染效率低和 siRNA 序列设计的效果不理想。如果您初次使用 siRNA 或采用了新的细胞系，并发现沉默效果不佳，我们建议您对转染效率进行检测，并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在，我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术，这也许能提高转染效率。如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求，可能是因为 siRNA 序列设计的效果不理想。问：用 100nM 的 siRNA 转染时只得到 50%沉默效率，我可以把 siRNA 的浓度增加到 200nM 甚至 400nM
10、吗？答：增加 siRNA 的浓度一般不能改进沉默效率。高浓度的 siRNA 将可能导致去靶作用和对细胞的毒性。siRNA 的高基因沉默效率来自于合理的设计，在 100nM 甚至更低的浓度都可能有 75%的沉默效率。另外，低的转染效率会导致低的沉默效率，建议您更进一步优化 siRNA 的导入条件。问：单基因保证产品为什么要强调 mRNA 水平检测？答：从 RNAi 的机制来讲，siRNA 最直接的所用就是 mRNA，通过使 mRNA 降解发挥“knowdown”的作用，因此强调 mRNA 水平检测是有理论依据的。很多客户认为，mRNA 的降解直接的结果应该是对应蛋白质含量的下降，因此蛋白水平的检
11、测结果也应该可以作为有效性的检测指标。事实上，很多情况下往往出现，mRNA 下降水平与蛋白下降水平不对应的现象。其可能原因有：（1）与选择的检测时间有关。可能因mRNA 的下降尚未反映在蛋白量的变化上或者未达到足以检测的水平，所以一般建议蛋白和功能检测时间要稍稍推后。（2）与蛋白在细胞中的表达情况有关。mRNA 的翻译过程非常复杂，细胞内基因的表达总要维持一个平衡，某些蛋白表达量到一定的程度之后，足以维持其细胞功能，将可能暂时“关闭”表达的功能，转录出来的部分 mRNA 可能不参与蛋白翻译的过程，因此，mRNA 水平的下调与蛋白水平下调并非完全成正相关的关系。（3）可能还会涉及到更加复杂的机制
12、。共有 3 条记录 共有 1 页 当前第 1 页 尾页 跳转到1siRNA 的转染 的常见问题及解答问：siRNA 导入细胞有哪些方法？哪种最好？答：siRNA 导入细胞有以下几种方法：脂质体转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说脂质体转染技术是最为常用的方法，而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。问：哪种转染试剂效果好？答：在选择转染试剂时，一般要考虑的是特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。我们推荐您首选曾在感兴趣的细胞中使用过的转染试剂。问：如何筛
13、选转染试剂？答：好的转染试剂有以下特点：1、对 siRNA 有较高的转染率；2、对细胞的毒性小。在 mRNA 水平检测siRNA 导入的效果比用看家基因的 siRNA 阳性对照检测更为准确。问：在转染时我发现有不少细胞死亡，应该如何处理？答：转染后大多数细胞死亡表明：转染条件需要进一步地优化。在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。例如：siRNA 与脂质体试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。共有 8 条记录 共有 2 页 当前第 1 页 尾页 跳转到1关于实验对照 的常见问题及解答问：有必要进行阴性对照吗？答：利用一个无任何靶基因的 siRNA 作为阴性对照
14、是很必要的。它能够帮助我们确认基因表达水平的降低是否是序列特异性的 RNAi 的结果。由于 siRNA 的合成方法和工艺以及转染试剂等因素可能导致广泛的基因沉默现象。如果没有阴性对照，研究人员很可能错误地将广泛的、非特异性基因沉默当作由 RNAi引起的基因特异性沉默。问：我从阴性对照实验中得到和特异性 RNAi 相同的结果，这说明了什么？答：这个观察结果说明了您用于实验的 siRNA 可能是非特异性的序列，同时也表明了阴性对照的重要性。问：用于对照的 siRNA 的最佳浓度是多少？答：阳性对照和阴性对照的 siRNA 的浓度都应该与基因特异性的 siRNA 的浓度相同。问：你们能提供预先合成的
15、 siRNA 对照么？答：可以。锐博能提供许多预先合成的用于 RNA 干扰实验的对照双链。共有 6 条记录 共有 2 页 当前第 1 页 尾页 跳转到1siRNA 订购 的常见问题及解答问：需要多少时间可以合成好 siRNA？答：常规 siRNA 的合成需要 4 个工作日。纯化增加 4 个工作日，脱保护/脱盐增加 1 个工作日。问：你们提供哪几种规格的 siRNA？答：锐博为您提供的 siRNA 的规格有 0.02， 0.2 和 1.0 umol。问：我们需要提供什么信息用于 siRNA 的合成？答：您需要准确地提供 siRNA 的 19 个核苷酸的靶序列和悬垂的合成物。我们将这 19 个序列
16、输入靶序列盒，计算机将自动计算正义链和反义链序列进行合成。注意：请您在提交定单前仔细核查靶序列。不要以“AA-N19”的格式提供靶序列，因为我们只需将 19 个核苷酸靶序列输入靶序列盒。问：siRNA 的定价是双链的还是单链的？答：锐博的定价是双链的。siRNA 标记 的常见问题及解答问：5修饰的 RNA 寡核苷酸链有哪些纯化方法？答：在固相合成中， 5修饰的 RNA 寡核苷酸链一般不需要进一步纯化。而在合成后，通常需要 PAGE 纯化。问：用 Cy3、Cy5 或生物素标记的单体的耦合效率各是多少？答：所有的这些标记的单体耦合效率通常能达到 90%以上。问：在固相合成中还是在合成后进行 5修饰？答：在固相合成中进行 5修饰。问：如何除去多余的标记？答：强阴离子交换或凝胶纯化将未结合的标记从修饰的 RNA 寡核苷酸链中除去。共有 9 条记录 共有 3 页 当前第 1 页 尾页 跳转到1RNAi 实验设计 的常见问题及解答问：如何检测荧光标记的 siRNA？答：荧光标记双链是最常用的优化转染条件
