实验操作步骤整理

《实验操作步骤整理》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验操作步骤整理（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、免疫组化免疫组化1.切片常规脱蜡至水化： 烧片 80oC，1h； 松节油 I 20min，II 15min； 100%乙醇 I 8min，II 5min； 95%乙醇 I 5min，II 5min； 75%乙醇 I 5min，II 5min； 蒸馏水 5 min x3; PBS 5min x1.2.失活内源性过氧化物酶 3% H2O2 37oC 20min; PBS 5min x3； 甩干。 3.抗原修复 A 9ml+B 41ml+450ml 水（柠檬酸缓冲液）400ml（360 水+40） 或：Tris-EDTA 修复 水浴 98oC 15min； 室温冷却； PBS 5min x3 甩干

2、4.血清封闭 37oC 30min； 甩干，不洗。 5.一抗（1:200 稀释）4oC 过夜（或室温 2-3h） ，对照加 PBS（稀释比例，来源） 6.PBS 5min x4； 二抗 37oC 30min； PBS 5min x37.SABC 染色 SABC 稀释 100 倍；990ul PBS +10ul SABC 或三抗孵育 37oC 30min. 8.DAB 染色 1ml 水中加 1 滴 A 摇匀，加 1 滴 B 和 1 滴 C 后摇匀，室温 1-2min。 水：双蒸水；A：浓缩缓冲液；B: DAB；C：H2O2 现配现用，配好后遮光，30min 内使用，剩余弃去。 9.复染 清水冲洗

3、，浸于苏木素中 1min 清水冲洗，盐酸酒精（1ml HCl，100ml 95%酒精）几秒钟 返蓝：清水冲洗 10min。 10.脱水 75%酒精 1min； 85% 1min； 95% 1min； 100% 4min。11.晾干后封片，标记，观察，截图，分析。常用单位换算 1M=1mol/L; 1uM=1umol/L;5%琼脂溶液：称取 5g 琼脂粉溶于 100ml 生理盐水。5%为质量分数单位，以 1L 水为 1Kg 算， 则 5g 每 100g 即 5g 每 100ml。免疫印迹常用抗原分子量 GAPDH 36KDa IGF 95KDaRNA 提取 准备试剂：氯仿，异丙醇，RNAse-f

4、ree-ddw(DEPC 水)，75%乙醇（ddw 配制） 。 1. 样品处理 1）样品处理：取新鲜或-70冻存组织，每 30-50mg 组织加入 1ml TRNzol-A+,匀浆处理，样 品体积一般不要超过积的 10%； 2）单层培养细胞：移出培养基，PBS 冲洗，加入 TRNzol-A+裂解细胞，每 10cm2面积加入 1ml TRNzol-A+;2. 将匀浆或裂解细胞在 15-30放置 5min，轻轻吹打，使核酸蛋白复合物完全分离；3. 4，1400rpm 离心，10min，取上清置-80冻存； 4. 每 1mlTRNzol-A+对应至少 0.2ml 氯仿，盖好瓶盖，剧烈震荡 15s,

5、室温放置 3min；5. 4，1400rpm 离心，10min，样品会分为三层：黄色有机相，中间层和上层无色水相； RNA 主要在水相中，把水相（约 500ul）转移到新管中。在得到的水相溶液中加入等体积异 丙醇，混匀，室温放置 20-30min；6. 4，1400rpm 离心，10min，去上清，离心后 RNA 位于管壁一侧底部形成胶水样沉淀； 7. 加入 1ml75%乙醇（DEPC 水配制）洗涤沉淀。1ml TRNzol-A+对应 1ml75%乙醇；8. 4，1400rpm, 10min,倾出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要 吸到沉淀； 9. 室温倒置 EP 管晾干，

6、加入 50ulDDW，反复吹打，混匀，充分溶解 RNA。Western blot 分离胶： 下层分离胶 10ml：dH2OArc-bis(30%)4xTris- SDD(PH8.8)AP(10%)TEMED8%4.73ml2.68ml2.5ml100ul4ul10%4.1ml3.3ml2.5ml100ul4ul12%3.4ml4.0ml2.5ml100ul4ul15%2.4ml5.0ml2.5ml100ul4ul上层浓缩胶 5ml：dH2OArc-bis(30%)4xTris- SDD(PH6.8)AP(10%)TEMED4%3.04ml0.67ml1.25ml40ul5ul5%2.865ml

7、0.83ml1.25ml50ul5ul厚板是上述的 1.5 倍： 下层分离胶 15ml：dH2OArc-bis(30%)4xTris- SDD(PH8.8)AP(10%)TEMED8%7.095ml4.02ml3.75ml150ul6ul上层浓缩胶 7.5ml：dH2OArc-bis(30%)4xTris- SDD(PH6.8)AP(10%)TEMED4%4.56ml1.005ml1.875ml60ul7.5ulRunning Buffer(10x, 1L)Tris-base30.3gGlycine144gSDS10g加入 DDW 补齐到 1L。小分子（180）Trans Buffer(10x

8、, 1L)Tris-base30.3gGlycine144g加入 DDW 补齐到 1L。稀释用 Trans Buffer(1x, 500ml)Trans Buffer 10x50ml甲醇100ml加入 DDW350ml 补齐到 500ml。大分子（180）Trans Buffer(1x, 500ml) Tris-base1.5gGlycine7.2gSDS0.1g甲醇100ml加入 DDW 补齐到 500ml。 大分子（180）Trans Buffer(1x, 600ml) Tris-base1.8gGlycine8.64gSDS0.12g甲醇120ml加入 DDW 补齐到 600ml。PBS

9、 配方 1L（细胞室用）：KH2PO40.2g(无水)Na2HPO412H2O3.49gNaCl8gKCL0.2g加入 DDW 补齐到 1L，滤过。PBS Buffer 1L：PH7.67.47.27.0NaCl(g)8.58.58.58.5Na2HPO4(g)2.22.22.22.2NaH2PO4(g)0.10.20.30.4加入 DDW 补齐到 1L。TBS （10x, 1L）NaCl87.66gTris12.11g加水补齐到 1L。 稀释用 TBST（1x, 1L）TBS 10x100ml纯水900mlTween2mlBSA Buffer 5%：TBST/PBS50mlBSA2.5gNa

10、N3（防腐）0.01g加入 50ml 的大离心管中溶解，以后分装使用。 NaN3 浓度：0.02%（g/ml）.一抗：BSA Buffer8ml抗体8ul1:1000 配制，加入 12ml 的小离心管中。 GAPDH 1:20000 配制。二抗：5%脱脂奶粉（质量体积比， 即 5g 溶于 100mlTBST 中）2.5g; 50mlRb/MS 抗体2ul1:25000 或 1:30000 稀释配制, 加入 50ml 的大离心管中溶解。稳定 transfection 带 GFP 的报告质粒 luciferase 报告质粒 G418 筛选 1. 预实验 G418 浓度； 2. 预实验及转染后消化铺

11、板的密度相近； 3. 正式实验过夜，加入 G418，大量死亡很正常； 4. 有限稀释法， 12 小时后观察可能出现单个细胞的孔，标记； 5. 2-3 天对标记的孔要格外关注； 6. 10 天，将长的足够大的单右 要小心消化下来， 至 24 孔放大。免疫共沉淀 1. 种板，6 孔板，3.5 皿，80-90%，处理； 2. 倾去培养基，预冷 PBS 冲洗两遍； 3. 加 500ml IP Buffer（提前加蛋白酶抑制剂） ，冰上裂解 15min，使刮刀； 4. 离心 1000r/5min（4最好） ； 5. 取上清 200ul 至新 EP 管中，剩余冻存； 6. 200ul+1ug 一抗，4孵育

12、 2-4h； 7. 加珠子 7ul，4，孵育过夜。 次日 8. 离心 3000r/3min，小心倾去上清，用 PBS 洗 3 次（避免剧烈震荡） ； 9. 10-30ul 上样缓冲液（2.5x, 20ul） 。转染 transfection 电击法，磷酸钙法，脂质体法，病毒介导法 真核细胞由于外源 DNA 掺入而获得新的遗传标志的过程 1. 瞬时转染，不整合，高水平表达，仅数天，多用于启动子和调控元件的分析，超螺旋 DNA。 2. 稳定转染，整合，低水平，持久，线性 DNA。MTT 分析法 吸光度 0-0.7 之间，否则不是直线关系 以活细胞代谢物还原剂 MTT 噻唑蓝为基础，MTT 为黄色化

13、合物，是种可以接受氢离子 的染料，作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 c 的作用下四唑环 开裂，生成蓝色的 formazan(甲瓒) 结晶，其生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀 酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原） 。formazan 结晶可溶解于含 50%的 N,N-二甲基酰胺和 20%的 十二甲基磺酸钠（pH4.7）的 MTT 或 DMSO，用酶标仪测定 490nm 处的光度值 OD 值，以 反映出活细胞的数目。 步骤： 1. 接种细胞：用含 10%FBS 培养基配成单个细胞悬液，以每孔 1000-10000 个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 200ul； 2.

14、 培养细胞： 同一般培养条件，培养 3-5 天（根据实验目的和要求定） ； 3. 呈色：培养之后，每孔加 DMSO 200ul，震荡 10min，使结晶充分溶解 4. 比色：选择 490nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光的值。Transwell1. Transwell 小室制备 无基质胶 Transwell 小室制备。1）包被基质膜；2）水化基质膜。 有基质胶 Transwell 小室制备。 2. 制备细胞悬液 无血清培养基饥饿 12-24h，去除血清的影响； 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用 PBS 洗 1-2 遍，用含 BSA 的无血清培养基 重悬，调整密度至 1-10x105

15、； 3. 接种细胞 取细胞悬液 100-200ul 加入小室； 下室加 500ul 含 FBS 或趋化因子的培养基； 培养细胞； 4. 结果统计 直接计数：贴壁细胞计数，非贴壁细胞计数； 间接技术：用于穿过细胞过多时。基因敲除 siRNA(small interfering RNA, 小分子干扰 RNA 片段)：双链 RNA 经酶切后会形成很多小片段， 其一旦与 mRNA 中的同源序列互补结合，会导致 mRNA 失去功能，即不能翻译产生蛋白质， 也就是基因沉默。 RNAi(RNA interference) ：双链 RNA 对基因的表达的阻断作用。 siRNA 的作用： RNA 病毒感染：病毒

16、被清除。外源双链 RNA 转座子的转录产物：转座子的表达被阻断。外源导入基因：外源导入基因被阻断。1. 起始阶段 Dicer 酶：是 RNase III 家族中特意识别双链 RNA 的一员，以 ATP 依赖方式逐步切割双链 RNA，使其降解为 19-21bp 的双链 RNA，每个片段的 3端都有 2 个碱基突出。 2. 效应阶段 siRNA 结合核酶复合物诱导 RNA 沉默复合物（RISC） ，激活 RISC 需一个 ATP 依赖的小分子 RNA 解双链过程，之后定位到同源 RNA 转录本上（碱基配对） ，并在距离 siRNA3端 12 个 碱基位置切割 mRNA。RNA 提取原理 Trizol 试剂：破碎和溶解细胞时保持 RNA 完整性。 氯仿：水相（RNA） ；中间层（DNA+蛋白） ；有机相（变性蛋白） 。 步骤：