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1、SSB 亲和层析使用说明书亲和层析使用说明书一、一、 简介简介噬菌体 T7 单链 DNA 结合蛋白（SSB, single-stranded DNA binding protein）由 696bp 核苷酸编码，计算分子量为 25.6kDa（SDS-PAGE 凝胶电泳，该蛋白条带约在 27 kDa 位置） 。它与单链 DNA 有很强的亲和性，且无序列特异性。利用这一特性，将 SSB 构建到不同宿主的表达载体中，可以实现在不同宿主中表达带有 SSB 标签的融合蛋白，从而与偶联在介质中的单链 DNA 高效、特异性结合，这种结合是可逆的，能够在温和、非变性的条件下通过改变洗脱液的 pH 值或盐浓度对融
2、合蛋白进行洗脱，达到纯化某一目标蛋白的目的。pSSB 系列载体用于构建可诱导、高水平表达的基因或基因片段，表达的融合蛋白的 N 端或 C 端带有 SSB 标签。SSB 标签可根据需要由位点特异的蛋白酶切除，pSSB 系列质粒上多克隆位点上游包含有肠激酶（enterokinase） 、凝血酶、TEV 等识别序列。带有标签的蛋白可以通过免疫学方法进行检测，同时根据实验需要决定是否切除标签。SSB 亲和层析介质（经过特殊处理的 ssDNA-cellulose）是专门设计用于纯化SSB 融合蛋白及与目的蛋白有亲和作用的蛋白复合体的分离介质，通过盐离子梯度洗脱可得到高纯度的 SSB 融合蛋白。纯化条件温
3、和，不引入其他物质，能够保证蛋白的活性。二、二、 pSSB 载体载体现有的 pSSB 载体系列按宿主不同可以分为以下四类：1）大肠杆菌类; 2）酵母类; 3）人细胞类；4）昆虫细胞类。每一个类别中均含有带有 N 端和 C 端的 SSB 标签质粒，每个质粒都含有相应的蛋白酶切位点，可以根据实验需要，将 SSB 标签从融合蛋白中切去。在不同的宿主载体中，它们的启动子也各不相同，通过各自的启动子实现严格调控插入片段的表达。相关参数如下页表一所示：表一：表一：pSSB 系列载体系列载体宿主宿主载体载体SSB 位于位于 目的蛋白目的蛋白 的的 N 端或端或 C 端端抗性抗性启动子启动子蛋白酶切蛋白酶切
4、位点位点是否带是否带 His 标签标签pSSB-E1N 端卡纳抗性T7肠激酶否pSSB-E2N 端卡纳抗性T7肠激酶是pSSB-E3N 端 （SSB( 26C)标签）卡纳抗性T7肠激酶是pSSB-E4N 端卡纳抗性T7凝血酶是pSSB-E5N 端卡纳抗性T7凝血酶否大肠杆菌大肠杆菌 E.colipSSB-E6C 端卡纳抗性T7肠激酶是pSSB-Y1N 端卡纳抗性nmt1肠激酶是pSSB-Y2N 端氨苄抗性nmt1肠激酶是酵母酵母 YeastpSSB-Y3C 端氨苄抗性nmt1肠激酶是pSSB-H1N 端氨苄抗性CMVTEV是人细胞人细胞HumanpSSB-H2C 端氨苄抗性CMV肠激酶是pSS
5、B-I1N 端氨苄抗性PH肠激酶是昆虫细胞昆虫细胞InsectpSSB-I2C 端氨苄抗性PH肠激酶是具体信息详见网站：具体信息详见网站：。三、三、 插入基因片段插入基因片段 每一个 pSSB 表达载体设计有多个克隆位点。 根据需要，DNA 片段可被插入到某一特定的位点。四、四、 优化表达优化表达插入 DNA 片段的方向和载体的连接确定无误后，下一步将要优化带 SSB 标签融合蛋白的表达，确定了最佳的蛋白表达水平及相应的生长条件后就可以进行大规模的培养。生长条件应考虑最佳的蛋白表达水平，确定一系列诸如培养基、生长温度、密度、诱导条件等参数。保证足够的通气条件、缩短各个生长时期的时间以及使用正确
6、的抗生素进行筛选都是非常重要的。同时应当确定表达的融合蛋白是在包涵体状态或可溶状态。SSB 在一定程度上可以促进目的蛋白的溶解，但有时候会因为过度表达而导致蛋白不能以正确的方式折叠，从而形成包涵体。为降低包涵体的形成，可以适当调整培养基条件来提高重组蛋白的溶解能力，如：生长温度降低至 15-30，增加通气，改变诱导条件如降低蛋白表达的速率等。五、五、 ssDNA-cellulosessDNA-cellulose 由单链 DNA（ssDNA）与处理过的 cellulose 进行偶联所得，大约 1g cellulose 可以偶联 2-3mg 的 ssDNA。ssDNA 可以与 SSB 特异性结合，
7、且1ml 溶胀好的 ssDNA-cellulose 柱料可以结合 1-2mg 的带有 SSB 标签的融合蛋白。此介质是自主设计合成的，具有优良的物理和化学稳定性，操作方便，批次重复性好，是研发的理想选择，具体性能参数如表二所示：表二：表二：ssDNA-cellulose 的性能参数的性能参数特点成本低，操作方便基质纤维素吸附载量1ml 吸附 1-2mg 的 SSB 融合蛋白介质平均直径100mpH 范围3-10保存温度4-8保存条件干燥保存六、六、 纯化纯化SSB 标签蛋白可以通过亲和层析柱（ssDNA-cellulose）比较方便的从细胞裂解物中纯化。纯化时，标签蛋白与配体结合，杂质通过结合
8、缓冲液被洗脱去除，之后标签蛋白在温和、非变性的条件下被洗脱下来，可以使蛋白的抗原性能和功能得以保护。如果需要将 SSB 标签从目的蛋白上切除，标签蛋白可以在与 ssDNA-cellulose 结合时使用合适的位点特异性蛋白酶酶切，也可在洗脱之后再酶切，在标签蛋白与介质结合时酶切可以节省分离 SSB 标签与目的蛋白的步骤，因为这样在洗脱目的蛋白时 SSB 标签仍旧结合在介质上。七、七、 操作说明操作说明1) 缓冲液配制：缓冲液配制：TE：10mM Tris-HCl （pH=8.0） ，1mM EDTA;结合缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH=8.0), 100 mM NaCl 或 10
9、0 mM KCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol。 （结合缓冲液的盐浓度可以根据要纯化的蛋白性质来调节）2) 操作步骤：操作步骤：1、 取适量 ssDNA-cellulose 干料，用 TE 缓冲液溶胀约 2-4 个小时。0.2g 干料可溶胀为 1ml 柱材料。装入层析柱后，用 5-10 倍的柱体积的 TE（pH=8.0）洗涤柱子，将未偶联的多余 DNA 去除。 2、用结合缓冲液平衡柱子 5-10 个床体积。 3、用上述结合缓冲液溶解表达的带有 SSB 标签融合蛋白的细胞，然后将其超声破碎或者裂解破碎，细胞裂解液高速离心后取其上清，缓慢注入层析柱，如果样品
10、挂柱效率低，可降低流速及重复上样。上样完毕后用平衡缓冲液再洗至基线。 4、用 5-10 个柱床体积的低盐（0.1 M NaCl 或 KCl）缓冲液洗脱杂蛋白。 5、然后，梯度性地提高盐浓度，洗脱目的蛋白。 3) 柱子再生：柱子再生：如果连续重复纯化同一个蛋白，柱子可以再生：首先用含有 1.5M 或 2M 的高盐缓冲液清洗柱子 5-10 个柱床体积，然后用大量蒸馏水清洗，最后用结合缓冲液重新平衡。如果长时间不用或者是纯化其它蛋白，建议重新使用新的柱材料进行纯化。4) 注意事项：注意事项：结合缓冲液可以随自己所需的要求进行适当更换，如可以使用 PBS 等其它buffer，但需注意的是，最好不要加入
11、 Mg2+，EDTA 的浓度保持在 2-5mM 左右。层析柱在纯化之前溶胀，时间 2-4 小时，由于 DNA 与 cellulose 是物理偶联，所以不建议长时间溶胀后使用，重复使用次数不要超过三次。八、八、 应用举例应用举例实例实例 1：将：将 Sap1 蛋白的基因重组于质粒蛋白的基因重组于质粒 pSSB-E4 中，并对表达的融合蛋白中，并对表达的融合蛋白 SSB- Sap1 进行纯化。进行纯化。在 E.coli 中表达的 SSB 融合蛋白，每升细胞培养物可以得到 3 至 30 毫克蛋白。不同的目的蛋白，表达起伏较大。下面详细介绍用 ssDNA-cellulose 纯化融合蛋白 SSB-Sa
12、p1 并用凝血酶对标签蛋白进行切割。Sap1 在裂殖酵母中大量存在，分子量为30kDa。通过 PCR 反应从裂殖酵母基因组 DNA 中扩增得到 Sap1 基因的 DNA 片段，插入到 pSSB-E4 载体的Bam HI 和 Hind III 位点。通过筛选获得的编码融合蛋白 6His-SSB-Sap1 的重组质粒转化到 E.coli BL21(DE3)pLysS 细胞中，次日，挑取单菌落接到 50ml 含有50g/ml 卡那霉素 LB 培养基中培养过夜。过夜的菌液以 1:100 的比例接到新鲜的培养基中，在 37培养至 OD600为 0.5 左右，加 IPTG 到 0.1mM 的终浓度，继续
13、37培养诱导 3.5h，然后离心收集细胞，用含有 0.4M NaCl 的结合缓冲液（50 mM Tris-HCl (pH=8.0), 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol）悬浮菌体，超声破碎细胞，37000g 离心 30 分钟。全细胞提取物，以及随后的细胞裂解液的沉淀和上清用 SDS-PAGE 检测，图一表明：6His-SSB-Sap1 融合蛋白可溶性高，离心后约 90%以上在上清中。由于 Sap1 蛋白对盐浓度较为敏感，所以我们选择先高盐得到可溶性蛋白后，将其稀释到 100mM 的盐浓度，高速离心后取上清再对其进行层析纯化。用 50 mM Tris-HCl (p
14、H=8.0) ，5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol 将6His-SSB-Sap1 的盐浓度调到 0.1M，再进行 ssDNA-cellulose 层析：1. 层析柱先用 TE 清洗 5-10 个柱床体积以去除未偶联的 DNA，后用结合缓冲液平衡 5-10 个柱床体积。2. 用注射器或蠕动泵加入已处理好的样品，为了获得最好的结果，上样时可以调低流速或者重复上样。3. 用结合缓冲液至少洗涤 5-10 个柱床体积，直到吸收达到平稳的基线或在流出物中没有物质流出。4. 低盐缓冲液 50 mM Tris-HCl (pH=8.0) ，0.2M NaCl，5 mM EDTA,
15、 2 mM DTT, 10% glycerol 洗涤柱子 3-4 个柱床体积以进一步去除非特异性结合的杂蛋白。5. 用高盐缓冲液 50 mM Tris-HCl (pH=8.0) ，0.4M NaCl，5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol 洗脱目的蛋白，分管收集。纯化结果如图二所示，根据密度测定法，6His-SSB-Sap1 的纯度可达到 96%左右。Figure1: The overexpression of the fusion proteins 6His-SSB-Sap1 in E.coli BL21(DE3) plys cells.取 100g6His-SS
16、B-Sap1 加入 1 单位的凝血酶在 0.1M NaCl，2.5M CaCl2，50 mM Tris-HCl (pH=8.0)，5 mM EDTA, 2 mM DTT，10% glycerol 中室温温育 2 到 5 个小时，如图三所示，6His-SSB-Sap1 融合蛋白被凝血酶充分酶解，6His-SSB 可以进一步通过镍-琼脂糖层析除去。实例实例 2：将：将 cds1 基因重组入质粒基因重组入质粒 pSSB-Y2 中，并对表达的融合蛋白中，并对表达的融合蛋白 SSB-Cds1 进行纯化进行纯化在酵母中表达的蛋白，一般表达量都很少，目的蛋白占总蛋白的量比例在1%左右甚至更低，只有用 western-bloting 才能检测出来，但是，酵母中表达的Figure2: The purification of 6His- SSB-Sap1 in E.coli cell extract with ssDNA-cellulose affinity chromatography.Figure3: Removal of 6H
