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1、1目录目录【摘要】.2【关键字】.21前言：.211 背景.2111 金黄色葡萄球菌蛋白 A(Staphylococcal protein A，SPA).2112 大肠杆菌.4113 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳） .4114 western blotting（Western 免疫印迹）.412 目的.513 原理.5131 SPA 的原核表达 .5132 蛋白的提取.6133 SDS-PAGE.7134 western blotting（Western 免疫印迹）.82材料与方法：.921 材料：.922 方法：.9221 SPA 的原核表达 .9222 蛋白质的提取
2、.11223 SDS-PAGE.11224 western blotting.14小结与心得体会.16参考文献.162【摘要摘要】构建携带 Staphylococcal protein A(SPA) 基因的原核表达载体，诱导表达具有活性的 SPA。然后再通过 western blotting，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。【关键字关键字】SPA，大肠杆菌，SDS-PAGE，western blotting1前言：前言：11 背景背景111 金黄色葡萄球菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白 A(Staphylococcal protein A，SPA)金黄色葡萄球菌细
3、胞壁的成分占整个细胞壁蛋白的 6.7，通过胞壁肽聚糖以共价键与之结合。SPA 能与人及多种哺乳动物血清 IgG 中的 Fc 片段结合，但亲和性各不相同。此外，其还能与血清中少量的 IgM 和 IgA 结合1。因此已广泛的应用于 IG 亚类的检测和分离纯化，酶的固定化及各类生物分子的检测等。SPA 还能部分去除肿瘤患者和带瘤动物血清中的封闭抗体，从而降低血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。由于 SPA 的一些特殊的免疫学特性，引起广大免疫学者的关注，并逐渐发展成为免疫学上一种极为有用的工具。近年来，有关 SPA 分泌型融合体系的构建已日趋完善，并已广泛用来在细胞中表达、纯化异源基因的产物233
4、。SPA 的生物学特性41免疫原性与过敏原性 SPA 做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成 Ig，又能与其相应抗体的 Fab 段结合呈现抗原抗体的特异性反应。SPAIgG 注射家兔皮下可引起 Arthus 样反应，还可引起豚鼠的迟发性超敏反应。SPA 体外试验，能刺激豚鼠离体回肠收缩。2抗吞噬作用 由于 IgG 的 Fc 段结合点既是 lgG 调理活性结合点，又是SPA 反应点。因此，SPA 可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是 SPA 阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。3固定补体 SPAIgG 和免疫复合物一样可以固定人和某些动物(如豚鼠、3猪、狗等)血清中的补体，主要是通
5、过补体传统激活途径。4促有丝分裂因子 SPA 是一种 B 细胞激活剂，固相 SPA 作用明显，并不需要 T 细胞辅助,可容性 SPA 作用微弱，必须有 T 细胞参与。5去封闭作用 固相 SPA 能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性，从而降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。SPA 的应用51SPA 菌的协同凝集作用用已知的标准血清，吸附到 SPA 菌的表面,使之成为吸附抗体的载体,再以此去诊断相应的未知抗原而产生肉眼可见的凝集颗粒,诊断的抗原可以是颗粒性的,也可以是可溶性的。此种凝集相当于反向间接血凝,但省去间接血凝中的抗体纯化,红血球鞣化等复杂手续,而只需要 SPA 菌体及粗制
6、免疫血清即可。所以此法简单、快速,特异性敏感性均较满意。目前已用于许多细胞和病毒的检测及分型。协同凝集只适用于检测抗原，未见应用于检测抗体的报道。2作为广谱第二抗体 用 SPA 代替抗体 IgG 的第二抗体，有如下优点：SPA 制备容易，性质稳定，易纯化，对人和多种哺乳动物的 IgG 都能应用,不受种属限制。而第二抗体的制备比较麻烦，且需多次免疫动物，在应用上要受同种属的限制；SPA 的结合力强，相当于游离抗体与抗原的结合力，对人和兔的亲和常数均为 103 L/克分子，结合后对 IgG 的活性无影响。无论在 0、37、44及 56几乎均能立即结合而无需长时间的孵育，因此可以缩短试验时间，第二抗
7、体在较长的孵育中，出现抗原分解的问题也可以得到解决；SPA 容易标上 125 I、荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白等，因此可与多种技术相结合；在检查细胞上的病毒抗原时，第二抗体往往特异性不强，会非特异性地与细胞膜上的 Fc 受体结合。SPA 分子高度均一，它不是免疫球蛋白，不受 Fc 受体影响，所以有较高的抗 IgG 特异性；用第二抗体做免疫沉淀试验时，必须将抗免疫球蛋白的浓度调整至等价，才能产生最佳的沉淀作用。而用SPA 菌沉淀，不受此限制，能保证彻底的沉淀；SPA 与 lgG 结合是可逆的，用 4mol/L 尿素、4mol/L 硫氰酸、盐酸(pH2.5)或鸟嘌呤盐酸盐等都可以使之重新解离。4
8、3用于提取纯化 IgG 利用 SPA 与 IgG 的结合特性提取 IgG，比常规采用硫酸铵、Sephadex 柱，DEAE 柱或免疫梯度离心等法要简便得多，而且纯度好。4检测和提纯 IgM IgM 在病毒的早期诊断中具有重要意义，为了检测特异性 IgM 抗体，必须首先在血清中除去 IgG。采用 SPA 菌吸附 IgG 是目前快速而又理想的办法，利用此法也为 IgM 的提纯开辟了道路。5其它方面 用于免疫复合物的检测、体外激活补体功能试验、细胞表面标记以及肿瘤表面抗原的检测等。112 大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌，Escherichia coli (T. Escherich 1885)属于细菌界、变
9、形菌门(Bacteria)、-变形菌纲(Proteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichia)、大肠杆菌种(E. coli)。113 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）目前最常用的分离蛋白质的电泳技术。SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS复合物基本上是相同的（约18m），但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影 响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与
