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1、肠道菌群细菌的鉴定一、实验目的 1.掌握革兰染色法。 2.掌握 IMViC 试验。二、仪器与试剂 玻片，接种环，生理盐水，酒精灯，结晶紫溶液，卢戈氏染液，石炭酸-复红溶液，沙黄液， 光学显微镜，二甲基氨基苯甲醛试剂，葡萄糖蛋白胨水培养基，甲基红试剂（甲基红 0.02g，95%酒精 60mL，蒸馏水 40mL） ，6%-萘酚酒精溶液，40% KOH，铵盐作为唯一氮 源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源的培养基，层析滤纸，正丁醇，甲酸，1.5%乳酸，1.5% 乙酸溶液，3%溴甲酚蓝酒精溶液，层析缸，需氧血琼脂平板，厌氧血琼脂平板，七叶苷培 养基，胆汁七叶苷培养基，65g/L NaCl 血清肉汤，PYR
2、试剂，DNA 琼脂平板，1 mol/L 盐酸， MRS 培养基，X-Gal。 三、实验步骤 1.革兰染色法 （1）涂片：取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握培养皿，右手 持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌， 待冷却后，取培养细菌少许与盐水混匀，直接取 12 环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。 接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。（2）干燥：目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然 干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰， 以致标本烤枯，不堪检视。（3）固定：手执玻片一端，标
3、本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共 2-3 秒，以 玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较 牢以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。 （4）初染：将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色 13 分钟，用流水 缓缓冲洗（即将龙头打开使水缓慢流出，将玻片倾斜使水在玻片面上端沿玻片流下冲洗染 液）直至无颜色流下为止。（5）媒染：加卢戈氏染液 45 滴作用 30 秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻 洒净。 （6）脱色：在 95%酒精缸中脱色约 35 秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反复 23 次， 直至流下酒
4、精略呈淡紫色为止，现按上法以流水冲洗，并将玻片轻轻洒净。（7）复染： 用稀释石炭酸-复红（或沙黄液）复染半分钟后按上法冲洗。（8）光学显微镜下观察细菌染色情况（9）G+菌被染成紫色；G-菌被染成红色。 2.大肠杆菌 （1）革兰染色法 实验结果应为被染成红色，即 G-菌。 （2）IMViC 试验 靛基质（吲哚）试验 斑点试验法：将一片滤纸放在培养皿的盖子上或一张载玻片上，滴加 11.5mL 二甲基氨基 苯甲醛试剂液于滤纸上使其变湿，取 1824h 琼脂平板培养物涂布于浸湿的滤纸上，在 13min 内观察。棕色的试剂由紫红变为红色者即为阳性。 甲基红（MR）试验：取一种细菌的 24h 培养物，接种
5、于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37培养 4872h，取出后加甲基红试剂 35 滴，立即观察结果。如果培养液呈红色者为阳 性，橙色者为可疑，黄色者为阴性。 二乙酰（V-P）试验：将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基后，于 3537培养 48h， 于 2mL 培养液内加入甲液（6%-萘酚酒精溶液）1mL 和乙液（40% KOH）0.4mL，摇振混 合。试验时强阳性者约于 5min 后，可产生粉红色反应。如长时间无反应，置室温过夜， 次日不变者为阴性。 枸橼酸盐利用试验：将被检细菌少量接种到培养基（铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐 作为唯一碳源）中，37培养 24d，观察培养基颜色变化。培养基变蓝色，
6、阳性；不变， 阴性。 实验结果应分别为：阳性，阳性，阴性，阴性。 3.乳酸杆菌 （1）革兰染色法 实验结果应为被染成紫色，即 G+菌。 （2）乳酸纸层析法 层析滤纸的制备将层析滤纸剪成 1.5cm*11cm 的长条状，在距层析纸一端约 4cm 处用 铅笔划线确定点阳线，使用前充分干燥。 配制展开剂正丁醇:甲酸:水=80:15:5 配制标准液配制 1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液。 制备待测样品将培养基菌种加入生理盐水 37培养 24h 后离心，收集上清液离心，收 集上清液。 点样用毛细管分别吸取发酵液，多次点样于滤纸条上，样点直径不宜超过 2mm，平衡 2h层析将点好样的层析纸放入，使点有样
7、品的一端浸在展开剂中，但不可浸及样点。观 察展开情况，待展开剂前沿到达离层析纸另一端约 1.5cm 处，取出层析纸。 显色以 3%溴甲酚蓝酒精溶液为显色剂，待层析液挥发之后，向层析滤纸喷洒并计算 Rf 值。 实验结果 Rf 值应该一致。4.脆弱拟杆菌 耐氧试验 从每个琼脂平板上挑取 45 个性状不同的菌落，每个菌落分别转种于 2 块需氧血琼脂平板和 1 块厌氧血琼脂平板(每个琼脂平板可划 46 区，每区种一个可疑菌落) ，然后将平板 分别放置在需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。 实验结果应为在厌氧环境生长，而在需氧和二氧化碳环境中不生长。5.肠球菌 （1）革兰染色法 实验结果应为被染成紫色，即
8、G+菌。（2）触酶试验 取洁净玻片 1 张，用接种环挑取细菌，加 3% H2O2 1 滴，立即观察结果。 实验结果应为无气泡，即阴性。（3）七叶苷水解试验 将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。 实验结果应为培养基变为黑色，即阳性。（4）65g/L NaCl 生长试验： 将待检菌接种 65g/L NaCl 血清肉汤中，35孵育 18-24h。 实验结果应为细菌生长且使得培养基变黄，即阳性。（5）PYR 试验： 挑取被检菌落在含有 PYR 的纸片上涂擦， 35孵育 5min，再于纸片上滴加 PYR 试剂，约 1min 后观察纸片颜色。 实验结果应为纸片呈红色，即阳性。6.梭杆菌属 （1）
9、靛基质（吲哚）试验 实验结果应为棕色的试剂由紫红变为红色者，即阳性。（2）DNA 酶试验法： DNA 琼脂平板上点种待检菌，35孵育 1824h，用 1 mol/L 盐酸倾注平板，观察结果。 实验结果应为菌落周围有透明区，即阳性。（3）触酶试验 取洁净玻片 1 张，用接种环挑取细菌，加 3%H2O2 1 滴，立即观察结果。 实验结果应为有气泡，即阳性。7.双歧杆菌 （1）革兰染色法 实验结果应为被染成紫色，即 G+菌。（2）在基础改良 MRS 培养基中添加 X-Gal，对双歧杆菌进行检测 双歧杆菌单独表面涂布呈白色或浅兰色，标准双歧杆菌表面涂布 3748h。培养后，双歧 杆菌呈白色或浅兰色,边缘整齐,表面隆起部分显白色，菌落背面观察呈兰色底晕，随机挑取5 个白色菌落经革兰氏染色涂片镜检，该菌为革兰氏阳性，呈各种分叉，V 形，棍棒状， 单个，成对，或链状排列，多种不规则形状，即可基本判定为双歧杆菌。 四、注意事项 使用革兰染色法应避免脱色的时间过少，以免将 G-菌染成紫色。
