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1、DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下,将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种 修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域,在人类基因组中有近5万个CpG岛5。正常 情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs 的活性异常与疾病有密切的关系,例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有 报道6表明，重度女性侵袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关 。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病 等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA
2、甲基化之间关系已经确定7，在SLE病 人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基 因沉默,基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活8, 都会导致细胞癌变。甲基化作用是转录水平上表达调控的基本方式之一。由于宿主细胞基因组DNA中不 同位点的甲基化程度存在某种平衡，并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这 种平衡及空间特征，破坏后的结构便成为宿主基因组防御系统识别的信号，使新整合的DNA序 列发生不同程度的甲基化，甲基化基因序列则通过抑制甲基化DNA结合蛋白(MeCP2)的结合而 抑制转录的顺利进行o。在拟南芥
3、中发现了DNA甲基化可以导致基因沉默汹埘。在基因沉默 过程中，外源或内源性信号引起部分DNA序列中CpG的甲基化，甲基化CpG结合域蛋白2(MeCP 2)结合到甲基化的胞嘧啶上聚集HDACs使组蛋白去乙酰化，该蛋白与去乙酰化的组蛋白通过聚 集更多的DNA 甲基转移酶来加强沉默信号，从而引起基因沉默H。DNA甲基化对染色质结构和基因表达的作用很可能是通过一组蛋白介导的，这 些蛋白可能含有共同的高度保守的甲基化的CpG结合结构域(MBD)L45 J。DNA甲基化在基因印记、x染色体失活、某些疾病的发生发展中发挥重要作用。其 直接作用机制可能是CpG岛甲基化干扰了一些转录因子(transcripti
4、on factor，TF)与基因调控区的结合，使甲基从DNA分子大沟中突出，从而阻止转录 因子与基因相互作用。间接机制可能是由于甲基化DNA与甲基化DNA结合蛋白结合 或DNA甲基化改变染色质结构，这2种情况都间接阻碍TF与DNA结合从而抑制转录 m1。DNA甲基化一般是通过转录抑制机制来调节特定基因的，具体的机制可能有：5 一MeC伸入DNA双螺旋大沟，影响转录因子的结合；序列特异的甲基化DNA结合蛋 白(MDBP一1，MDBP一2)与甲基化的启动子序列特异性结合而抑制转录因子与靶序 列的结合；甲基化CpG结合蛋白(MeCPl，MeCP2)与甲基化的二核苷酸CpG结合，发 挥类似转录抑制蛋白
5、的作用H“。一般DNA甲基化会通过干扰转录因子与识别位点结 合和招募组蛋白乙酰转移酶(histon acefltransfeI“SeS，HATs)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)形成辅助阻遏复合体，使基因沉默而抑制其表达，而去甲基化 则使沉默的基因重新激活卜 甲基化尤其是基因启动子区岛的高甲基化，会导致基因表达的下降或沉默。 甲基化抑制基因的表达目前认为要有两个方面，一方面甲基化引起的基因结构改变可直接阻碍一些转录因子与其结合位的结合；另一方面可能与一些甲基化相关蛋白 的作用有关，甲基化 结合蛋白可以占据转录因子的结合位点，从而抑制基因的表达未甲基化的
6、CpG岛通常是转录因子Spl的结合位点，而CpG甲基化可导致基因转录 被抑制。基因的上游启动子区域通常被认为是CpG密集的区域。然而，我们对不同 内含子中CpG岛的出现情况进行分析，结果发现5601的第一内含子序列至少具 有一个CpG岛，而其它内含子中，具有CpG岛的序列比例只有1407，远远低于 第一内含子。对不同位置内含子(即第一内含子，第二内含子等) 中的CpG岛进行统计发现，其它任何位置具有CpG岛的内含子比例也均低于第一内 含子(图1)。例如，223的基因第二内含子中含有CpG岛，第三内含子中有CpG 岛的比例为1758。这再次表明相对于其它内含子，小鼠基因的第一内含子中C pG岛最
7、密集。这个现象说明基因第一内含子中很可能含有与Spl相关的转录调控元 件死亡相关蛋白激酶(deathassociated protein kinase，DAPK)是一种由钙调蛋白调节的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，是细胞凋亡的 正性调节因子之一【3 J。DAPK可被多种因子激活，如INF1、Fas、TNF B、Ceramide(神经酰胺)、ERK、C myc和E2F等，提示它可能是各种细胞凋亡诱导信号的一个汇合点HJ。DAPK基因 启动子的甲基化是目前肿瘤研究的热点之一，现已发现人类多种肿瘤组织中DAPK 基因表达缺失与其基因甲基化有关剖。另一方面，有实验表明，肿瘤患者血浆D NA水平明显高于正常人，
8、肿瘤患者外周血中游离DNA带有恶性细胞DNA的生物学 特性，。DNA甲基化主要是由DNA甲基转移酶催化，S一腺苷蛋氨酸提供甲基给胞 嘧啶，形成5甲基胞嘧啶。5一甲基胞嘧啶是真核细胞中唯一存在的天然修饰方式 ，占3一4。启动子区富含CpG序列，故易发生甲基化由于在经典形式(如mPerl、mCryl、mDBP和mMKPl中)和非经典形式(如mPer2中)的 Ebox中常常包含DNA甲基化潜在靶点CpG双核苷酸，因此有研究推测E box的甲基化极可能参与分子水平的节律性表达一J。此外大多数E box都位于CpG岛中，附近其他CpG岛序列的甲基化亦可能调节E box的节律性功能活动。在肿瘤组织和细胞系
9、中发现一些E box和CpG岛在发育过程中被甲基化州3|。本实验组前期实验41结果也表明mPe rl的Ebox3和Ebox4发生明显甲基化。甲基化CpG结合域蛋白1(methyl-CpGbinding domain protein 1，MBDl)是一个重要的转录调控因子，它可通过调控DNA甲基化，进而控制肿瘤 甲基化相关基因的表达 ，而DNA异常甲基化可干扰基因的转录过程，引起抑癌基因的失活，导致肿瘤的 发生雎。甲基化CpG结合域蛋白MBDl是一个重要的转录调控因子，它可通过结合DNA甲基化位点，调控基因的甲基化，进而控制甲基化相关基因的转录表达，已 发现MBDl在多种恶性肿瘤组织和细胞系中均
10、存在高表达【6在DNA甲基化过程中，胞嘧啶从DNA双螺旋突出进入与酶结合部位的裂隙，通过甲基 转移酶，把活性甲基从S腺苷甲硫氨酸转移至5胞嘧啶位上，形成5甲基胞嘧 啶。DNA甲基转移酶分两种：一种是维持DNA甲基转移酶(maintenance DNA methyltransferase)，即DNMTI，主要在模板链的指导下使复制后处于半甲基化的DN A双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化，这样就获得与亲本DNA完全相同 的甲基化形式，从而构成了表遗传信息在细胞和个体世代间的传递机制；另一种是 重新DNA甲基转移酶(de novo DNAmethyltransferase)，即DNMT3a
11、和DNMT3b，它们可在未甲基化的DNA双链上进行 甲基化，不需要母链的指导，主要负责发育所需的重新甲基化以及异常甲基化的形 成。然而在某些情况下，DNMTl和DNMT3也可以分别发挥重新甲基化和维持甲基化的 作用6。DNA甲基化对哺乳动物的正常发育至关重要，通过基因敲除证明DNMTl和D NMT3b对于胚胎发育是必需的，而缺乏DNMT3a的小鼠将在出生后几周内死亡7，8。 甲基化有许多重要的生物学意义，它通常被看作转录抑制的标志，并得到了大多数 人的认可。抑制转录的机制可能有3种9：(1)南京医科大学博士学位论文DNA甲基化直接干扰特异转录因子与各自启动子的识别位置结合， 减低了序列特异的转
12、录因子结合的亲和忙k10，1 1。甲基基团不影响碱基配对但可影响蛋白伸入DNA大沟中与DNA相互作用。(2)甲 基化转录抑制是通过在甲基化DNA上结合特异的转录阻遏物(repressor)而起作用。 目前发现这一类甲基CpG结合蛋白主要有MeCP2、MeCPlMBDl、MBD2、MBD4等12 14】。它们能与特定DNA序列 中甲基化的胞嘧啶结合，从而阻断转录因子与基因调控序列的结合。(3)DNA甲基化 后可通过甲基一CpG结合蛋白募集组蛋白去乙酰化酶(HDAC)形成复合物，使组蛋 白去乙酰化，导致染色质结构聚集，从而抑制基因的转录15。正常情况下，哺乳 动物DNA甲基化状态受到严密的调控，如
13、女性的一条X染色体因高度甲基化而失活； 持续的低甲基化状态使看家基因一直处于活性转录状态；在生物发育的某一阶段或 细胞分化的某种状态下，原先处于甲基化状态的基因可被诱导去除甲基化而出现转 录活性。DNMT抑制剂：如5氮杂脱氧胞苷(5- azadC，地西他滨)等，可使抑癌基因CpG岛高甲基化得到解除，从而重新激活抑癌 基因，起到治疗作用。目前已在白血病、骨髓增生异常综合征、非小细胞肺癌等肿 瘤中取得了很好的疗效53。(2)HDAC抑制剂： 如曲古抑菌素A、苯丁酸盐等。对肿瘤细胞的选择性大于对正常细胞的选择性、副 作用少，是HDAC抑制剂优于其他药物的重要特点。HDAC抑制剂能抑制组蛋白去乙酰 化
14、，改变参与细胞存活和分化的蛋白水平，如增加抑癌基因的表达和减少抗凋亡基 因的表达，从而抑制体外或动物模型中瘤细胞的增殖，或诱发瘤细胞的分化和凋亡 。(3)靶向诱导DNA甲基化：对于低甲基化高表达的肿瘤相关基因，则可以诱导其启 动子甲基化，使该基因沉默。靶向诱导DNA甲基化，是针对某基因启动子或其附近的区域设计一段甲基化的寡核苷酸链(MON)，使其与靶基因中一条DNA链的特定位点 结合，形成半甲基化的中间体，该中间体成为DNMTl的底物，使DNA另一条链也发 生甲基化，从而使靶基因的特定位点完全甲基化。实验证明，运用这一原理设计的 针对IGF2与GSTPl基因启动子区域的甲基化寡核苷酸链，能有效
15、地诱导基因启动子 甲基化，而减少基因的表达54，55。(4)应用RNA干扰技术：用双链RNA或小片段 干扰RNA(siRNA)转染细胞，含有启动子序列的RNA能降解同源的mRNA，或指导同源 的DNA启动子甲基化，导致基因沉默；也可选择性地耗竭DNMT的mR_NA，降低DNMT的 活性，恢复沉默基因的表达。目前认为OPQ 甲基化后抑制基因转录导致基因失活的机制可能在以下几个方面：!基因启动子甲 基化后可直接阻止转录因子与启动子结合；“甲基化结合蛋白与甲基化的OPQ 特异结合后会与转录因子竞争结合OPQ 的结合位点，或使染色体高度聚集，不适于转录；#间接通过组蛋白去乙酰基酶（S OQH-）作用发
16、生组蛋白去乙酰化，去乙酰化后的组蛋白与OPQ 结合能力增强，转录因子不易进入启动子区域而抑制转录。 ：基因转录的表达抑制是以H,L 岛甲基化的积累剂量为依赖的F，有学者认为，H,L 岛甲基化只有达到一定比例（ D ;?N）时，才足以完全抑制基因表达，而低比例的甲基化只能降低基因的转录表达 9。与遗传引起的变化不同，表观遗传导致的改变是潜在可逆的。H.(* 等G?采用去甲基化因子“$T$#10)%)* 处 理具有!“ #$%&()* 甲基化阳性的细胞后，细胞恢复了!“ #$%&()* 的/UPQ 功能和蛋白表达，这对于研究开发去甲基化药物治疗肿瘤具有重要意义。由此可见 ，研究肺癌!“ #$%&()* 基因启动子H,L 岛甲基化与蛋白表达的关系具有深远的临床意义。甲基化抑制基因甲基化抑制基因转录转录的机制的机制甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互
